反相色谱使用非极性固定相和极性流动相根据疏水性分离分子。它是分析化学和蛋白质组学中使用最广泛的液相色谱模式。

原理

固定相由共价键合到硅胶或聚合物颗粒上的烷基链（C₄、C₈、C₁₈或苯基）组成。流动相是水和可与水混溶的有机溶剂如乙腈、甲醇或异丙醇的混合物。极性化合物与非极性固定相相互作用弱，较早洗脱，而非极性化合物分配进入固定相，随着有机溶剂浓度增加而较晚洗脱。保留由分析物的疏水性决定，用log P（辛醇-水分配系数）描述。

固定相

C₁₈（十八烷基）柱最常用，为广泛分析物提供强保留。C₈（辛基）柱保留略低且选择性不同。C₄柱优选用于蛋白质，因为较短的烷基链减少变性。苯基柱添加芳香π-π相互作用。核壳（熔融核）颗粒结合实心核和多孔壳，减少扩散路径长度并在无需超高压力的条件下提高效率。亚2 µm全多孔颗粒实现UHPLC分离。

流动相

水相通常是含0.1%甲酸（用于MS）、0.05% TFA（用于肽）或磷酸盐缓冲液（用于UV检测）的水。有机相是乙腈（低UV截止、低粘度）、甲醇（更高粘度、不同选择性）或异丙醇（强洗脱剂，用于极疏水化合物）。梯度洗脱在10–60分钟内将有机比例从5%增加到95%。等度洗脱使用恒定组成进行简单分离。

保留与选择性

保留因子k’描述分析物被保留的强度。选择性α描述两个峰之间的分离。分辨率Rₛ结合了保留、选择性和效率。柱长、粒径、流速、温度和梯度斜率均影响分辨率。板高与线速度的范第姆特分析有助于优化给定柱的效率。

胰蛋白酶肽图谱

RPC是蛋白质组学中肽作图的优选方法。蛋白质用胰蛋白酶消化，该酶在赖氨酸和精氨酸残基后切割。所得肽在C₁₈柱上用乙腈梯度分离。每种蛋白质产生特征性肽图。在自下而上蛋白质组学中，RPC柱直接连接到电喷雾电离质谱仪。纳流RPC柱（75 µm内径，填充3 µm C₁₈）在200–300 nL/min下提供分析低纳克蛋白质样品所需的灵敏度。多维分离在MudPIT工作流程中结合强阳离子交换与RPC。

脱盐

RPC还用作脱盐或缓冲交换步骤。在水性条件下上样到C₁₈捕获柱上的肽被保留，而盐和亲水污染物通过。短梯度将清洁后的样品直接洗脱进入质谱仪（捕获-洗脱配置），改善电离稳定性和灵敏度。

应用

RPC应用于药物分析（药物纯度、稳定性测试）、临床化学（治疗药物监测、类固醇谱分析）、食品分析（农药残留、添加剂）和环境分析（水中的污染物）。在生物技术中，RPC分析重组蛋白变体、脱酰胺产物和氧化物种，对产品质量评估至关重要。通过RPC进行的肽作图是生物药物身份和批次一致性的放行检测。