概述

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 可测量单个细胞的转录组，为细胞异质性提供前所未有的分辨率。 Bulk RNA-seq 对数百万个细胞的基因表达进行平均，掩盖了不同细胞类型的不同转录状态。相比之下，scRNA-seq 分别捕获每个细胞的表达谱，从而能够发现稀有细胞群、重建发育轨迹以及表征细胞类型特异性反应。自 2009 年首次 scRNA-seq 研究以来，该技术发展迅速，现代平台可在一次实验中分析数万个细胞。

方法

scRNA-seq 工作流程包括细胞分离（使用基于液滴的平台，如 10x Genomics Chromium、微流体技术，如 Fluidigm C1 或基于板的方法）、使用独特分子标识符 (UMI) 进行反转录以消除扩增偏差，以及用于测序的文库制备。生物信息学分析通过：质量控制（通过基因计数、线粒体含量和 UMI 计数过滤细胞）、归一化（SCTransform、scran 或 BASiCS）、批量校正（Harmony、Seurat’s CCA 或 scVI）、降维（PCA 后进行 UMAP 或 t-SNE 可视化）、聚类（Louvain 或 Leiden 算法）以及 之间的差异表达集群。细胞类型注释使用标记基因和参考数据库。

应用程序

scRNA-seq 已经改变了多个领域。它为人体器官创建了全面的细胞图谱，绘制了发育中胚胎的图谱，并揭示了大脑和免疫系统中以前未知的细胞亚型。在癌症研究中，scRNA-seq 可以剖析肿瘤异质性和肿瘤微环境，识别罕见的耐药性与流式细胞术相关的细胞状态 标记。该技术建立在核心RNA 测序 原理和DNA 微阵列和基因表达 概念之上。新兴的空间转录组学方法现在为单细胞数据添加了位置背景，揭示了细胞在组织内的组织方式。

实用协议

典型的 10x Genomics scRNA-seq 实验首先制备浓度为 700-1200 个细胞/μL 且活力高于 90% 的单细胞悬浮液。 Chromium 控制器将细胞划分为纳升级凝胶珠乳液 (GEM)，每个凝胶珠包含一个带有独特 10x 条形码和 UMI 的条形码珠。在 GEM 内进行逆转录后，将带有条形码的 cDNA 汇集并扩增。文库构建涉及酶促片段化、末端修复、A 加尾、接头连接和样本索引 PCR。测序在 Illumina 平台上进行，读取配置为 R1 28 个循环（10x 条形码和 UMI）、R2 91 个循环（cDNA 插入）和 i7 索引 8 个循环。 Cell Ranger 管道使用“cellranger mkfastq”将原始 BCL 文件处理为 FASTQ，然后通过“cellranger count”使用 STAR 将读数与参考基因组进行比对。输出包括过滤后的特征条形码矩阵、UMAP 嵌入和聚类结果。 R 中的下游分析使用 Seurat：“CreateSeuratObject”、“SCTransform”进行标准化，“RunPCA”和“RunUMAP”进行降维，以及使用 Leiden 算法的“FindClusters”。在 Python 中，Scanpy 提供了类似的函数：“sc.pp.filter_cells”、“sc.pp.normalize_total”、“sc.pp.log1p”、“sc.tl.pca”和“sc.tl.leiden”。建议在聚类之前使用“DoubletFinder”或“scrublet”进行双峰检测，并且可以使用“Harmony”或“scVI”执行跨样本的批量集成。