超临界流体色谱法（SFC）使用超临界流体——即处于临界温度和临界压力以上的物质——作为流动相。二氧化碳（CO₂）是最广泛使用的流体（T_c = 31.1°C，P_c = 73.8 bar），因为它无毒、不可燃、化学惰性且易于获取。作为超临界流体，CO₂具有类液体的密度（提供溶剂化能力）和类气体的粘度和扩散性（实现高流速、低背压和快速传质），从而产生比HPLC更快更高效的分离。

SFC仪器包括能够输送液态CO₂（通常经过冷却）的泵、用于添加有机共溶剂的改性剂泵、进样器、柱温箱、用于维持系统压力的背压调节器（BPR）以及检测器。BPR必须使流动相在整个色谱柱中保持超临界状态，然后在检测前允许减压。通常添加改性剂如甲醇、乙醇或乙腈（通常1-40%）以增加CO₂的溶剂强度，因为单独的CO₂是非极性的，不足以洗脱极性分析物。加入水或酸性/碱性添加剂可进一步扩展极性范围。

SFC的一个关键优势是其与多种检测器的兼容性。UV/Vis检测最为常见，但SFC与质谱法（MS）自然兼容，因为CO₂流动相易挥发且易于去除，与HPLC-MS相比背景较低。当使用不含有机改性剂的CO₂时，可以实现火焰离子化检测（FID）（与HPLC不同），使SFC-FID成为定量非紫外吸收化合物如脂质和碳氢化合物的强大工具。手性分离在SFC中特别成功，因为低粘度流动相允许使用长手性色谱柱获得高效率，且CO₂的溶剂化性质常增强手性识别。

与HPLC相比，SFC提供更短的分析时间、更低的溶剂消耗（降低成本和环境影响）以及更快的色谱柱平衡。与GC相比，SFC无需衍生化即可分析热不稳定和非挥发性化合物。SFC广泛应用于制药行业的手性分离、纯度分析和快速色谱纯化。在天然产物领域，SFC分离脂质、萜烯和精油。该技术已成为制备型手性分离的首选方法，因为从CO₂中去除溶剂大大简化了产品分离。