表面等离子体共振实时测量分子的结合和解离，无需荧光或放射性标记。它是确定结合亲和力、结合速率和解离速率的标准方法。

原理

SPR 检测金传感器表面折射率的变化。一个相互作用物被固定在传感器表面。含有另一个相互作用物的溶液流过表面。当分析物分子与配体结合时，表面质量增加，改变折射率。这种变化被连续测量并绘制为传感器图谱。

传感器图谱

典型的 SPR 实验包括：

1. 基线：缓冲液流过表面。
2. 结合：注入分析物；响应随结合发生而增加。
3. 平衡：结合速率等于解离速率；响应达到平台。
4. 解离：缓冲液替代分析物；响应随复合物解离而降低。

在相同的配体表面上注入多个分析物浓度，生成一系列传感器图谱。将数据全局拟合到 1:1 结合模型得到 ka、kd 和计算的 KD。

仪器

Biacore 是使用最广泛的 SPR 平台。传感器芯片具有镀金表面，涂有羧甲基化葡聚糖基质，为固定化提供亲水环境。其他平台包括 Sierra Sensors、Reichert 和 Nicoya。

固定化方法

• 胺偶联：最常用的方法。葡聚糖表面的羧基用 EDC/NHS 活化，形成与配体上伯胺反应的活性酯。简单但方向随机。
• 捕获偶联：捕获分子被胺偶联，配体从粗制品或纯化制品中被捕获。确保均一方向，允许表面再生而不损伤配体。
• 生物素-链霉亲和素：生物素化配体被捕获在链霉亲和素包被的表面。近共价稳定性，定向固定化。

应用

• 亲和力排序：筛选具有最高亲和力的抗体克隆。
• 表位分箱：确定两种抗体是否结合重叠表位。
• 浓度分析：使用无校准方法测量活性浓度。
• 小分子分析：现代 SPR 仪器可检测小至 100 Da 的分子。
• 动力学表征：药物候选物的完整 ka、kd 和 KD 测定。

局限性

SPR 需要相对纯的配体并了解结合化学计量。质量传输限制可能扭曲动力学，通过使用高流速和低配体密度解决。必须通过优化运行缓冲液最小化非特异性结合。