二维聚丙烯酰胺凝胶电泳在第一维按等电点、第二维按分子量分离复杂蛋白质混合物，在单块凝胶中生成数百至数千个蛋白质斑点的高分辨率图谱。

原理

2D-PAGE结合两种正交分离原理。在第一维中，蛋白质根据其净电荷通过等电聚焦分离。在第二维中，它们通过SDS-PAGE根据分子量分离，与标准一维SDS-PAGE相同。结果是一个二维斑点阵列，每个斑点对应特定的蛋白质亚型或修饰状态。

第一维——等电聚焦

样品在含有尿素、硫脲、CHAPS去垢剂、DTT和载体两性电解质的缓冲液中溶解。固定化pH梯度条提供稳定、可重复的pH梯度，范围从窄（pH 4–7）到宽（pH 3–10）。条带用样品复溶，然后在递增电压（300–8000 V）下聚焦数小时至数十千伏小时。蛋白质迁移到其净电荷为零的pH——其等电点。聚焦后的条带在第二维前在DTT（还原）和随后碘乙酰胺（烷基化）中平衡。

第二维——SDS-PAGE

将平衡后的条带放置在聚丙烯酰胺板胶顶部并用琼脂糖密封。SDS包被的蛋白质垂直迁移通过凝胶，按分子量分离。标准Laemmli凝胶或梯度凝胶（例如8–16%丙烯酰胺）改善了跨质量范围的分辨率。分子量标志物加样在一端。蛋白质通过考马斯亮蓝、银染、SYPRO Ruby或荧光标记可视化。

样品制备

样品质量对可重复的2D凝胶至关重要。蛋白酶和磷酸酶抑制剂必不可少。蛋白质用TCA/丙酮沉淀或使用清除试剂盒去除盐、脂质和核酸，这些物质会干扰聚焦。样品通过Bradford或BCA法定量。对于膜蛋白，额外的去垢剂或有机溶剂可改善溶解。

检测与分析

凝胶通过光密度扫描并使用PDQuest、Delta2D或Melanie等软件分析。斑点检测、跨凝胶匹配和归一化生成定量丰度数据。差异表达的斑点通过统计检验识别。感兴趣的斑点被切取并通过质谱在胶内胰蛋白酶消化后鉴定。

优势与局限

2D-PAGE可解析带有翻译后修饰的完整蛋白质，这些修饰使斑点水平移动（磷酸化、乙酰化）或垂直移动（糖基化）。银染检测限为每斑点1 ng，考马斯为100 ng。局限性包括极酸性或碱性蛋白质（pI < 3或> 10）、膜蛋白（疏水性在聚焦过程中聚集）、非常高和低分子量蛋白质（> 200 kDa或< 10 kDa）以及低于检测限的低丰度蛋白质的代表性差。可重复性需要所有步骤的仔细标准化。

应用

2D-PAGE是蛋白质组学中差异表达分析的基石，比较健康和患病组织、处理和未处理细胞系或发育阶段。它绘制蛋白质亚型和翻译后修饰图谱，提供功能性蛋白质组的快照。2D差异凝胶电泳使用CyDye标记（Cy3、Cy5、Cy2）在同一凝胶中运行两个或三个样品，消除凝胶间变异并提高定量准确性。