UV-Vis（紫外-可见）光谱是一种分析技术，可测量电磁波谱的紫外（190-400 nm）和可见光（400-800 nm）区域的光吸收情况。它广泛用于分子中电子跃迁的定量分析、动力学研究和表征。

紫外-可见光吸收原理

当光穿过样品时，分子吸收能量与电子轨道之间的能隙相匹配的光子，从而促进电子从基态进入激发态。每个波长处吸收的光量被记录为吸收光谱，最大吸收波长（λmax）是每个发色团的特征。比尔-朗伯定律 (A = εcl) 将吸光度 (A) 与摩尔吸光率 (ε)、光程 (c) 和浓度 (l) 联系起来，从而实现定量。

仪器仪表

紫外-可见光谱仪由多个组件组成。氘灯提供紫外线范围的光，卤钨灯提供可见光范围的光。单色仪（衍射光栅或棱镜）选择窄带波长。样品室装有用于紫外测量的石英比色皿或用于可见光范围测量的玻璃比色皿，探测器（光电倍增管或光电二极管阵列）将透射光转换为电信号。双光束仪器将光分成样品光束和参考光束，以校正溶剂和灯的波动。

应用程序

紫外-可见光谱可用于核酸 (A260)、蛋白质 (A280) 和酶动力学 的定量分析，通过测量吸光度随 pH 的变化确定 pKa 值，药物、食品着色剂和水污染物的质量控制，以及过渡金属络合物和共轭有机化合物的表征。

优点和局限性

• 优点：快速、非破坏性、需要的样品量小且相对便宜。
• 局限性：仅测量发色物质；样品必须是透明的并且没有散射颗粒。

实用紫外-可见光谱实验方案

将仪器预热 15-30 分钟以使灯稳定。选择石英比色皿进行 UV 测量 (<350 nm)，因为玻璃和塑料会吸收 UV 光；仅使用一次性塑料或玻璃比色皿进行可见光范围测量。握住比色皿的磨砂面，以避免光学窗口上留下指纹。将空白溶液（仅溶剂或缓冲液）填充到参考比色皿中，将分析物溶液填充到样品比色皿中。将参考比色皿插入参考光路中，并将样品插入样品光路中。对于单光束仪器，首先收集空白的基线光谱，然后替换为样品。以中速 (200 nm/min) 执行 200–800 nm 的波长扫描，以确定 λmax — 最大吸光度的波长。对于固定波长下的定量分析，请将仪器设置为分析物的 λmax。测量一系列标准溶液（跨越预期范围的 5-7 个浓度）和未知样品的吸光度。通过绘制吸光度与浓度的关系来构建校准曲线。拟合线性回归 — 比尔-朗伯定律 (A = εbc) 指出，只要吸光度在 0.1 到 1.0 之间（大多数仪器的线性范围），该关系应该是截距接近于零的线性关系。如果吸光度超过 1.0，请稀释样品。对于 260 nm 处的 DNA 定量，对于双链 DNA，使用每 OD 单位 50 ng/μL 的消光系数；对于单链 DNA，使用每 OD 单位 33 ng/μL 的消光系数。纯度通过 A260/A280 比率（纯 DNA 约为 1.8，纯 RNA 约为 2.0）和 A260/A230 比率（> 2.0）进行评估。对于 280 nm 处的蛋白质定量，测量纯化蛋白质的 A280 并使用蛋白质的摩尔消光系数计算浓度。对于酶动力学，可在固定波长下监测吸光度随时间的变化，例如，在 340 nm (ε = 6220 M-cm-1) 处消耗 NADH，以测量脱氢酶活性。

实际应用

在对乙醇脱氢酶的研究中，乙醇氧化为乙醛与 NAD⁺ 还原为 NADH 耦合，NADH 在 340 nm 处吸收。使用 0.1–10 mM 乙醇在 340 nm 处、30°C 下监测反应 5 分钟。绘制初始速度与底物浓度的关系图，并拟合 Michaelis-Menten 方程，得出 Km = 1.2 mM 和 Vmax = 85 µM/min。