X射线晶体学通过测量晶体衍射X射线的角度和强度来确定蛋白质和其他大分子的三维原子结构，然后计算电子密度图，并从中构建原子模型。

原理

当X射线照射晶体时，会被原子的电子云散射。晶体的规则间隔晶格在特定角度产生相长干涉——衍射——由布拉格定律描述。测量衍射点的位置和强度可以重建电子密度分布。然后通过拟合原子模型来解释该密度图，并根据观测数据进行精修。

蛋白质结晶

衍射需要具有规则三维有序的晶体。将蛋白质纯化至>95%均一性，浓度为5–20 mg/mL。结晶筛选测试数百种条件，改变沉淀剂（PEG、硫酸铵）、pH、缓冲液、盐和添加剂。坐滴和悬滴气相扩散是标准方法。蛋白质和储液池溶液的液滴与较大储液池平衡，浓缩蛋白质并促进成核。适合衍射的晶体在数天至数周内生长，并用冷冻环收获。

数据收集

晶体在液氮中于100 K快速冷却以减少辐射损伤。衍射数据在同步辐射光束线收集，提供高强度、可调谐的X射线束。完整数据集包括数百至数千张衍射图像，在晶体每张图像旋转小角度范围时收集。使用XDS、iMosflm或DIALS处理数据，对反射进行指标化、积分强度和缩放测量。分辨率限由具有可测量强度的最高角度反射定义；蛋白质结构通常为2.0–3.0 Å。

相位问题

测量强度提供振幅但不提供相位，而相位是重建电子密度的傅里叶变换所必需的。分子置换通过将同源结构模型放置在晶体学晶胞中并计算其预测衍射来解决相位，从而提供初始相位。当没有良好的搜索模型时，实验定相使用重原子衍生物（MIRAS）或通过硒代甲硫氨酸掺入硒（MAD/SAD）。现代流程自动化了大部分过程。

模型构建与精修

初始电子密度图在Coot或类似软件中解释，其中多肽链被追踪，侧链被放置。模型经历手动调整和计算精修的迭代循环，使用phenix.refine或REFMAC5。精修优化模型以最小化计算和观测结构因子之间的差异。质量通过Rwork和Rfree监测。可靠的结构通常在2.5 Å分辨率下Rfree低于0.25。

验证

MolProbity验证主链几何、旋转异构体异常、碰撞分数和拉马钱德兰统计。模型与实验电子密度之间的相关性通过实空间R因子评估。所有提交生成的PDB验证报告提供标准化的质量摘要。推荐标准：>90%拉马钱德兰优选，<0.3%拉马钱德兰异常，<1%旋转异构体异常。

应用

X射线晶体学已确定了蛋白质数据库中大多数已知蛋白质结构。它阐明了酶催化机制、药物-靶标相互作用包括HIV蛋白酶和激酶抑制剂，以及大型大分子复合物如核糖体。与NMR波谱和冷冻电镜一起，它构成了结构生物学的核心工具包。