Elektroforesis gel agarosa adalah teknik laboratorium mendasar yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Ketika para ilmuwan perlu menganalisis DNA setelah pencernaan restriksi, PCR, atau pemurnian, mereka beralih ke elektroforesis gel untuk memvisualisasikan hasilnya. Meskipun gel agarosa lempengan tetap menjadi standar untuk analisis DNA rutin, elektroforesis gel kapiler (CGE) menawarkan alternatif otomatis dengan throughput tinggi dengan deteksi fluoresensi yang diinduksi laser, yang banyak digunakan dalam pembuatan profil DNA forensik dan pengurutan DNA.
Cara Kerja Elektroforesis Gel Agarosa
Teknik ini bergantung pada fakta bahwa DNA bermuatan negatif dan akan bermigrasi menuju elektroda positif ketika ditempatkan dalam medan listrik.
- Mempersiapkan Gel
Bubuk agarosa dicampur dengan buffer TAE atau TBE (biasanya 1× TAE atau 0,5× TBE) dan dipanaskan hingga larut. Agarosa cair dituangkan ke dalam nampan pengecoran dengan sisir dimasukkan untuk membuat sumur. Saat mendingin, ia mengeras menjadi matriks gel berpori.
- Memuat Sampel
Sampel DNA dicampur dengan pewarna pemuatan yang mengandung gliserol (untuk membuatnya tenggelam) dan pewarna pelacak (untuk memantau migrasi). Sampel dipipet ke dalam lubang gel. Tangga DNA—campuran fragmen dengan ukuran yang diketahui—dimuat di lubang pertama sebagai referensi ukuran.
- Elektroforesis
Arus listrik dialirkan melintasi gel. Karena DNA bermuatan negatif, fragmen-fragmen tersebut bergerak melalui gel menuju elektroda positif. Fragmen yang lebih kecil bergerak melalui pori-pori gel dengan mudah dan bergerak dengan cepat, sedangkan fragmen yang lebih besar bergerak lebih lambat. Seiring waktu, fragmen-fragmen tersebut terpisah menjadi pita-pita berbeda berdasarkan ukurannya.
- Visualisasi
Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA seperti etidium bromida atau SYBR Safe. Ketika ditempatkan di bawah sinar UV, pewarna berfluoresensi, memperlihatkan pita DNA. Dengan membandingkan posisi pita dengan tangga DNA, para ilmuwan dapat menentukan ukuran setiap fragmen.
Protokol Elektroforesis Gel Praktis
Pilih persentase agarosa berdasarkan ukuran fragmen yang diharapkan: 0,7% untuk 0,8–10 kb, 1,0% untuk 0,5–5 kb, 1,5% untuk 0,2–3 kb, dan 2,0% untuk 0,1–1 kb. Timbang agarosa dalam jumlah yang sesuai (misalnya, 1 g untuk gel 1%) dan tambahkan 100 mL buffer 1× TAE. Panaskan dalam microwave sampai agarosa larut sepenuhnya — aduk setiap 30 detik untuk mencegah panas berlebih. Dinginkan hingga ~60°C, tambahkan 5 µL GelGreen atau etidium bromida (10 mg/mL), campur, dan tuang ke dalam baki tuang dengan sisir dimasukkan. Biarkan mengeras selama 20–30 menit. Tempatkan gel dalam tangki elektroforesis yang diisi dengan 1× TAE. Campurkan 5 µL setiap sampel DNA dengan 1 µL pewarna 6× loading (mengandung gliserol dan bromofenol biru). Muat seluruh volume ke dalam sumur. Muat 5 µL tangga DNA 1 kb Plus di sumur pertama dan terakhir. Jalankan pada 5–10 V/cm (diukur dari jarak antar elektroda) — untuk gel 10 cm, biasanya 80–100 V. Jalankan hingga bagian depan pewarna bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira dua pertiga panjang gel (30–60 menit). Visualisasikan pada transilluminator UV (302 nm untuk etidium bromida, 470 nm untuk GelGreen) dan foto. Untuk aplikasi hilir (ekstraksi gel), gunakan UV dengan panjang gelombang panjang (365 nm) untuk meminimalkan kerusakan DNA.
Aplikasi Dunia Nyata
Setelah PCR mengamplifikasi fragmen gen berukuran 1,5 kb, 5 μL produk dijalankan pada gel agarosa 1% di sepanjang tangga 1 kb. Pita tunggal terang pada 1,5 kb menegaskan keberhasilan amplifikasi tanpa dimer primer atau produk nonspesifik. Gel difoto, dan pita dipotong di bawah sinar UV untuk pemurnian dan kloning.
