Mengisolasi kultur bakteri murni dari sampel campuran adalah langkah pertama dalam setiap alur kerja mikrobiologi — baik untuk diagnosis klinis, pengujian keamanan pangan, atau penelitian.

Media Kultur

Bakteri ditumbuhkan dalam formulasi kaya nutrisi yang menyediakan karbon, nitrogen, mineral, dan sumber energi. Media diklasifikasikan berdasarkan komposisi:

• Media terdefinisi (sintetis): setiap komponen kimia diketahui. Digunakan untuk studi metabolik.
• Media kompleks: mengandung hasil pencernaan bahan hewan atau tanaman (pepton, tripton, ekstrak ragi). LB (Luria-Bertani) broth adalah media kompleks paling umum untuk E. coli.
• Media selektif: mengandung inhibitor (antibiotik, garam empedu, pewarna) yang menekan bakteri yang tidak diinginkan sementara memungkinkan organisme target tumbuh. Contoh: agar MacConkey (memilih bakteri Gram-negatif), agar manitol garam (memilih stafilokokus).
• Media diferensial: mengandung indikator yang membedakan jenis bakteri. Agar MacConkey bersifat selektif dan diferensial — fermentor laktosa berubah menjadi merah muda, non-fermentor tetap tidak berwarna.
• Media diperkaya: ditambah dengan darah, serum, atau faktor pertumbuhan untuk mendukung organisme fastidious. Agar darah (5% darah domba) adalah media diperkaya yang paling umum.

Streak Plating

Metode kuadran streak mengisolasi koloni tunggal dari kultur campuran:

1. Sterilkan loop inokulasi dengan memanaskan hingga merah membara, lalu dinginkan dengan menyentuh tepi agar steril.
2. Ambil sejumlah kecil sampel bakteri.
3. Streak kuadran pertama dalam pola zigzag rapat.
4. Panaskan loop, dinginkan, dan seret melalui kuadran pertama ke kuadran kedua.
5. Ulangi untuk kuadran ketiga dan keempat, panaskan di antara masing-masing.
6. Inkubasi terbalik pada suhu yang sesuai (37 °C untuk sebagian besar patogen, 30 °C untuk isolat lingkungan).

Setelah inkubasi, koloni terisolasi muncul di sepanjang streak kuadran akhir di mana kepadatan sel paling rendah.

Spread Plate dan Pour Plate

Teknik spread plate mendistribusikan suspensi bakteri yang diencerkan secara merata di seluruh permukaan plat agar menggunakan spreader kaca steril. Ini digunakan untuk mengkuantifikasi jumlah bakteri (CFU/mL).

Teknik pour plate mencampur sampel yang diencerkan dengan agar cair sebelum dituangkan ke dalam plat. Koloni tumbuh baik di permukaan maupun di dalam agar. Ini berguna untuk menghitung organisme toleran panas dan untuk mendeteksi jumlah organisme yang rendah.

Kondisi Inkubasi

Inkubasi standar adalah pada 37 °C di udara selama 18–24 jam. Variasi meliputi:

• Kapnofilik: 5–10% CO₂ (beberapa patogen, misalnya, Neisseria).
• Anaerobic: atmosfer bebas oksigen menggunakan toples atau ruang anaerobic (misalnya, Clostridium, Bacteroides).
• Mikroaerofilik: oksigen rendah, CO₂ tinggi (misalnya, Campylobacter).
• Termofilik: 55–60 °C (Thermus aquaticus).