Elektroforesis zona kapiler (CZE) adalah mode elektroforesis kapiler yang paling mendasar dan banyak digunakan. Pada CZE, kapiler diisi dengan elektrolit latar belakang (BGE) yang kontinu dan seragam, dan sampel dimasukkan sebagai sumbat sempit di ujung inlet. Di bawah pengaruh medan listrik yang diterapkan, setiap analit bermigrasi dengan kecepatan karakteristiknya, ditentukan oleh jumlah mobilitas elektroforetiknya dan aliran elektroosmotik (EOF). Analit yang berbeda dalam muatan atau ukuran bermigrasi pada kecepatan yang berbeda dan dipisahkan menjadi zona-zona diskrit saat mereka bergerak menuju detektor. CZE diterapkan pada berbagai kelas analit, dari ion anorganik kecil dan produk farmasi hingga peptida, protein, dan fragmen asam nukleat.
Mekanisme Pemisahan Zona
Kecepatan migrasi bersih suatu analit dalam CZE adalah jumlah vektor dari kecepatan elektroforetiknya (menuju elektroda yang bermuatan berlawanan) dan kecepatan elektroosmotik (biasanya menuju katoda). Pada pH di atas 3, EOF umumnya lebih kuat daripada mobilitas elektroforetik sebagian besar anion, sehingga semua analit — kation, netral, dan anion — terbawa menuju detektor di ujung katoda. Kation bermigrasi paling cepat karena migrasi elektroforetiknya searah dengan EOF. Analit netral bermigrasi pada kecepatan EOF dan ko-elusi sebagai puncak tunggal yang tidak terpisah, itulah sebabnya CZE tidak cocok untuk spesies netral tanpa modifikasi. Anion bermigrasi paling lambat karena migrasi elektroforetiknya berlawanan dengan EOF, dan anion dengan mobilitas lebih besar dari EOF dalam arah yang berlawanan tidak akan pernah mencapai detektor. Jendela pemisahan ditentukan oleh waktu migrasi penanda netral (t_EOF) dan waktu munculnya anion paling lambat.
Komposisi Buffer dan Selektivitas
Pemilihan BGE adalah alat yang paling kuat untuk mengendalikan selektivitas dalam CZE. pH buffer menentukan keadaan ionisasi analit asam dan basa dan oleh karena itu muatan efektif dan mobilitasnya. Untuk pemisahan peptida dan protein, pH diatur ke nilai di mana spesies yang diminati memiliki muatan bersih yang berbeda secara signifikan, biasanya dalam kisaran 2 hingga 9. Kekuatan ionik buffer mempengaruhi besarnya EOF dan ketebalan lapisan ganda listrik; kekuatan ionik yang lebih tinggi mengurangi EOF dan memampatkan lapisan ganda, meningkatkan resolusi tetapi meningkatkan arus dan pemanasan Joule. Pelarut organik seperti asetonitril atau metanol dapat ditambahkan ke BGE untuk mengubah kelarutan analit, mengubah konstanta dielektrik, dan memodifikasi EOF. Pemisahan kiral dicapai dengan menambahkan siklodekstrin atau selektor kiral lainnya ke BGE, yang membentuk kompleks diastereomer sementara dengan enansiomer.
Pelat Teoritis dan Resolusi
Pemisahan CZE ditandai dengan jumlah pelat yang sangat tinggi, seringkali melebihi 200.000 pelat per meter. Pelebaran zona dalam CZE didominasi oleh difusi longitudinal, karena profil EOF yang datar menghilangkan pelebaran yang diinduksi aliran yang membatasi efisiensi HPLC. Jumlah pelat teoritis (N) diberikan oleh N = (µ_app V) / (2 D), di mana µ_app adalah mobilitas semu, V adalah tegangan yang diterapkan, dan D adalah koefisien difusi. Resolusi antara dua puncak tergantung pada perbedaan mobilitas semu mereka, jumlah pelat rata-rata, dan kecepatan elektroosmotik. Resolusi dapat ditingkatkan dengan meningkatkan tegangan yang diterapkan (hingga batas pemanasan Joule), memperpanjang panjang kapiler efektif, mengurangi EOF (dengan menurunkan pH atau menggunakan kapiler berlapis), atau mengoptimalkan komposisi buffer untuk memaksimalkan perbedaan mobilitas antara analit.
Penumpukan Sampel untuk Sensitivitas yang Ditingkatkan
Sensitivitas konsentrasi CZE dengan deteksi absorbansi UV dibatasi oleh panjang jalur optik yang pendek dan volume injeksi yang kecil (biasanya 1 hingga 20 nL). Teknik prakonsentrasi pada kapiler, yang secara kolektif dikenal sebagai penumpukan (stacking), secara dramatis meningkatkan sensitivitas dengan memekatkan zona sampel sebelum pemisahan dimulai. Field-amplified sample stacking (FASS) memanfaatkan perbedaan konduktivitas antara matriks sampel (konduktivitas rendah) dan BGE (konduktivitas tinggi). Ketika tegangan diterapkan, medan listrik yang lebih tinggi di zona sampel konduktivitas rendah menyebabkan ion analit bermigrasi dengan cepat hingga mencapai batas BGE, di mana mereka melambat dan terakumulasi dalam pita sempit. Sweeping menggunakan fase pseudostasioner seperti misel untuk menangkap dan memfokuskan analit netral atau bermuatan. Isotakoforesis transien (tITP) menggunakan sistem elektrolit pemimpin dan penghenti untuk memfokuskan analit ke dalam zona tajam, mirip dengan isotakoforesis kapiler, sebelum beralih ke pemisahan CZE. Metode penumpukan ini dapat memberikan peningkatan sensitivitas 10 hingga 1000 kali lipat, membawa batas deteksi UV ke kisaran nanomolar rendah.
Aplikasi di Laboratorium Klinis
CZE banyak digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein serum, di mana ia telah menggantikan elektroforesis gel agarosa untuk elektroforesis protein serum (SPEP) rutin. Protein serum terpisah menjadi lima fraksi utama — albumin, alfa-1, alfa-2, beta, dan gamma globulin — dan elektroferogram dievaluasi untuk gammopati monoklonal, pola inflamasi, dan defisiensi protein. CZE juga merupakan metode pilihan untuk skrining hemoglobinopati, memisahkan varian hemoglobin seperti HbA, HbF, HbS, dan HbC pada pH alkali. Dalam analisis farmasi, CZE digunakan untuk pengujian kemurnian obat, penentuan lawan-ion, dan profiling pengotor kiral. Dalam proteomik, CZE yang digabungkan dengan spektrometri massa (CZE-MS/MS) memberikan pemisahan peptida efisiensi tinggi untuk identifikasi protein bottom-up, yang sangat menguntungkan untuk sampel volume rendah dan peptida basa yang menantang untuk LC-MS fase terbalik.
Pertimbangan Pengembangan Metode
Pengembangan metode CZE dimulai dengan memilih pH BGE berdasarkan nilai pKa analit. Buffer fosfat atau borat pada pH 2,5 adalah titik awal yang umum untuk molekul kecil dan peptida. Dimensi kapiler (panjang, diameter dalam) dan tegangan yang diterapkan dipilih untuk menyeimbangkan kecepatan analisis dengan resolusi. Suhu kolom dikontrol dengan pendinginan udara paksa atau cairan untuk menghilangkan panas Joule, dan kapiler dibilas di antara pengoperasian dengan natrium hidroksida, air, dan BGE untuk menjaga reproduktifitas. Untuk analisis kuantitatif, standar internal ditambahkan untuk mengoreksi variabilitas volume injeksi, dan metode divalidasi untuk linearitas, presisi, akurasi, dan ketangguhan sesuai pedoman ICH.
