Kromatografi kolom adalah metode pemurnian yang paling banyak digunakan dalam kimia organik. Ini memisahkan senyawa berdasarkan partisi diferensial antara fase gerak (pelarut) dan fase diam (adsorben).
Fase Diam
- Silika gel (SiO₂): fase diam yang paling umum. Ini polar dan menahan senyawa polar lebih kuat. Ukuran partikel berkisar dari 40–63 µm untuk flash chromatography hingga 15–40 µm untuk HPLC.
- Alumina (Al₂O₃): tersedia dalam bentuk basa, netral, dan asam. Kurang umum daripada silika tetapi berguna untuk senyawa sensitif-basa dan pemisahan di mana silika menyebabkan degradasi.
- Silika fase terbalik C18: silika yang dimodifikasi dengan rantai oktadesil (C18), menjadikannya non-polar. Digunakan dengan fase gerak polar (air, metanol, asetonitril). Kromatografi fase terbalik adalah standar untuk memisahkan senyawa non-polar hingga cukup polar.
Fase Gerak (Eluen)
Sistem pelarut dipilih dengan kromatografi lapis tipis (TLC). Targetnya adalah Rf 0,2–0,4 untuk senyawa target. Mulailah dengan pelarut non-polar (heksana, petroleum eter) dan tambahkan modifier polar (etil asetat, metanol) dalam proporsi yang meningkat. Elusi gradien — mulai dengan polaritas rendah dan meningkat secara bertahap — memberikan pemisahan terbaik.
Flash Chromatography
Flash chromatography menggunakan udara tekan atau nitrogen untuk mendorong pelarut melalui kolom pada 1–10 bar, mengurangi waktu pemisahan dari jam menjadi menit. Sistem flash modern (Biotage, Teledyne Isco) menggunakan kartrid pra-paket dengan pompa gradien dan detektor UV terintegrasi yang secara otomatis mengumpulkan fraksi ketika puncak terdeteksi.
Pengaturan flash manual:
- Kemas kolom kaca dengan silika — baik kering (ketuk untuk mengendapkan) atau bubur (tuangkan suspensi silika–pelarut).
- Terapkan sampel sebagai larutan pekat atau diadsorpsi ke sejumlah kecil silika (dry load).
- Tambahkan lapisan pasir di atas untuk melindungi permukaan silika.
- Terapkan tekanan pelarut dan kumpulkan fraksi dalam tabung.
- Analisis fraksi dengan TLC. Gabungkan fraksi murni dan evaporasi.
Koleksi Fraksi dan Deteksi
Fraksi biasanya 5–20 mL tergantung pada ukuran kolom dan kesulitan pemisahan. TLC adalah metode standar untuk menentukan fraksi mana yang mengandung senyawa yang diinginkan. Senyawa aktif-UV dapat dideteksi di bawah lampu UV 254 nm. Pewarnaan plat TLC dengan KMnO₄, p-anisaldehida, atau ceric ammonium molybdate memvisualisasikan senyawa non-UV-aktif.
Fase Normal vs. Fase Terbalik
Fase normal (silika, fase gerak non-polar) memisahkan berdasarkan polaritas — senyawa non-polar terelusi lebih dulu. Fase terbalik (C18, fase gerak polar) memisahkan berdasarkan hidrofobisitas — senyawa polar terelusi lebih dulu. Fase terbalik dominan dalam HPLC analitis tetapi kurang umum dalam pemurnian organik preparatif, di mana silika fase normal tetap menjadi standar.
