La cromatografía en columna es el método de purificación más utilizado en química orgánica. Separa compuestos basándose en su partición diferencial entre una fase móvil (disolvente) y una fase estacionaria (adsorbente).

Fases Estacionarias

• Sílica gel (SiO₂): la fase estacionaria más común. Es polar y retiene los compuestos polares más fuertemente. Los tamaños de partícula van de 40–63 µm para cromatografía flash a 15–40 µm para HPLC.
• Alúmina (Al₂O₃): disponible en formas básica, neutra y ácida. Menos común que la sílice pero útil para compuestos sensibles a bases y separaciones donde la sílice causa degradación.
• Sílice de fase reversa C18: sílice modificada con cadenas de octadecilo (C18), haciéndola no polar. Se usa con fases móviles polares (agua, metanol, acetonitrilo). La cromatografía de fase reversa es el estándar para separar compuestos no polares a moderadamente polares.

Fase Móvil (Eluyente)

El sistema de disolventes se selecciona mediante cromatografía en capa fina (TLC). El objetivo es un Rf de 0.2–0.4 para el compuesto diana. Comience con un disolvente no polar (hexano, éter de petróleo) y añada un modificador polar (acetato de etilo, metanol) en proporciones crecientes. La elución en gradiente — comenzando con baja polaridad y aumentando gradualmente — proporciona la mejor separación.

Cromatografía Flash

La cromatografía flash utiliza aire comprimido o nitrógeno para impulsar el disolvente a través de la columna a 1–10 bar, reduciendo el tiempo de separación de horas a minutos. Los sistemas flash modernos (Biotage, Teledyne Isco) utilizan cartuchos preempacados con una bomba de gradiente y un detector UV integrado que recolecta automáticamente fracciones cuando se detecta un pico.

Configuración manual de flash:

1. Empaque una columna de vidrio con sílice — ya sea en seco (golpee para asentar) o en suspensión (vierta una suspensión de sílice-disolvente).
2. Aplique la muestra como una solución concentrada o adsorbida en una pequeña cantidad de sílice (carga seca).
3. Añada una capa de arena en la parte superior para proteger la superficie de sílice.
4. Aplique presión de disolvente y recolecte fracciones en tubos.
5. Analice las fracciones por TLC. Combine las fracciones puras y evapore.

Recolección de Fracciones y Detección

Las fracciones son típicamente de 5–20 mL dependiendo del tamaño de la columna y la dificultad de separación. La TLC es el método estándar para determinar qué fracciones contienen el compuesto deseado. Los compuestos activos a UV pueden detectarse bajo una lámpara UV de 254 nm. La tinción de la placa TLC con KMnO₄, p-anisaldehído o molibdato de amonio cérico visualiza compuestos no activos a UV.

Fase Normal vs. Fase Reversa

La fase normal (sílice, fase móvil no polar) separa por polaridad — los compuestos no polares eluyen primero. La fase reversa (C18, fase móvil polar) separa por hidrofobicidad — los compuestos polares eluyen primero. La fase reversa es dominante en HPLC analítica pero menos común en purificación orgánica preparativa, donde la sílice de fase normal sigue siendo el estándar.