A medida que las construcciones de biología sintética crecen en complejidad, la clonación por restricción tradicional se vuelve poco práctica. El ensamblaje Gibson y la clonación Golden Gate permiten el montaje de múltiples fragmentos en una sola reacción en un solo tubo.

Ensamblaje Gibson

El ensamblaje Gibson une múltiples fragmentos de ADN con extremos solapantes en una sola reacción isotérmica a 50 °C. La mezcla de reacción contiene tres actividades enzimáticas:

• 5’ exonucleasa (T5 exonucleasa o RecE): elimina los extremos 5’ del ADN de doble cadena, dejando extensiones 3’ monocatenarias que permiten la hibridación de fragmentos complementarios.
• ADN polimerasa (Phusion o Taq): llena los huecos que quedan después de la hibridación.
• ADN ligasa (Taq ligasa): sella los cortes en el ADN ensamblado.

Cada fragmento debe tener 15–40 pb de homología con su vecino en la unión. Estas superposiciones se añaden mediante cebadores de PCR. El ensamblaje Gibson puede unir 2–15 fragmentos simultáneamente. El montaje es sin cicatrices — no quedan sitios de restricción en el producto final.

La reacción requiere 50–100 ng de cada fragmento en cantidades equimolares y se completa en 15–60 minutos a 50 °C. El producto se transforma directamente en E. coli químicamente competente. El ensamblaje Gibson es ideal para:

• Ensamblar genes sintéticos a partir de oligonucleótidos.
• Construir plásmidos completos a partir de fragmentos solapantes.
• Construir casetes de ingeniería genómica con brazos de homología.
• Crear bibliotecas de ADN para evolución dirigida.

Clonación Golden Gate

La clonación Golden Gate utiliza enzimas de restricción de tipo IIS (BsaI, BpiI, Esp3I) que cortan fuera de su secuencia de reconocimiento, produciendo extensiones monocatenarias definidas de 4 pb. Estas extensiones pueden ser especificadas por el usuario.

La reacción es una digestión-ligación simultánea: la enzima tipo IIS y la ADN ligasa T4 se añaden juntos en un solo tubo, y la mezcla de reacción se cicla entre la temperatura óptima de la enzima (37 °C para BsaI) y 16 °C o 37 °C (para la ligación). Debido a que los sitios de reconocimiento se eliminan del producto ensamblado final, la reacción se lleva a completitud — el producto ensamblado no puede ser digerido nuevamente.

Golden Gate es la base de los estándares de clonación modular como MoClo, Golden Braid y Plant Toolbox. Es ideal para:

• El montaje combinatorio de partes genéticas (promotores, UTR 5’, CDS, terminadores, etiquetas).
• La construcción de matrices TALEN a partir de módulos repetidos individuales.
• La construcción de bibliotecas de sgRNA agrupadas para pantallas CRISPR.

Las extensiones se diseñan para ser mutuamente compatibles en un orden definido, permitiendo que el mismo vector acepte diferentes combinaciones de partes. Golden Gate es más escalable que el ensamblaje Gibson para proyectos combinatorios modulares, aunque requiere que los fragmentos carezcan de sitios de reconocimiento internos para la enzima utilizada.