Clonación Gateway

La clonación Gateway utiliza el sistema de recombinación sitio-específica del bacteriófago lambda. Elimina la necesidad de enzimas de restricción y ADN ligasa mediante el uso de secuencias de recombinación reconocidas por enzimas específicas.

El sistema funciona en dos reacciones:

• Reacción BP: un producto de PCR flanqueado por sitios attB se recombinación con un vector donante (pDONR) que contiene sitios attP. La mezcla de enzimas BP clonasa cataliza la reacción, produciendo un clon de entrada con el inserto flanqueado por sitios attL.
• Reacción LR: el clon de entrada se recombinación con un vector destino que contiene sitios attR. La LR clonasa transfiere el inserto al vector destino, que proporciona los elementos de expresión apropiados (promotor, etiqueta, marcador de selección) para el organismo diana.

La clonación Gateway es direccional, preserva el marco de lectura y permite transferir el mismo clon de entrada a docenas de vectores destino (p. ej., para expresión en bacterias, células de mamífero, levaduras o plantas). La principal limitación es el tamaño de los sitios de recombinación (attB1 y attB2 son ~50 pb cada uno), que añaden aminoácidos adicionales a la proteína expresada a menos que se eliminen mediante un paso de escisión con proteasa.

Clonación TOPO

La clonación TOPO utiliza la topoisomerasa I del virus Vaccinia, que corta el ADN y permanece unida covalentemente al fosfato 3’. Un vector TOPO linealizado tiene topoisomerasa unida a ambos extremos. Cuando se añade un producto de PCR con extremos compatibles, la topoisomerasa religa el vector, insertando el producto de PCR — no se necesita ligasa.

TOPO TA cloning: La ADN polimerasa Taq añade una sola extensión 3’-A a los productos de PCR. El vector TOPO tiene extensiones 3’-T complementarias. El producto de PCR se mezcla con el vector linealizado a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se transforma en células competentes. Es el método de clonación más simple disponible, sin necesidad de digestión con restricción, ligación o purificación post-PCR.

TOPO blunt-end cloning: Los productos de PCR con extremos romos (de polimerasas con capacidad correctora) se clonan usando una versión del vector TOPO optimizada para ligación de extremos romos. La eficiencia es comparable a la clonación TA con el vector correcto.

Elegir Entre Ambos

La clonación TOPO es más rápida (5 minutos a temperatura ambiente) y más adecuada para la subclonación rápida de un solo inserto. Gateway requiere más preparación (adaptadores attB en los cebadores de PCR, vectores de entrada y destino separados) pero escala a aplicaciones de alto rendimiento y hace que cambiar entre sistemas de expresión sea trivial.