Ligasi dan kloning DNA adalah serangkaian teknik yang digunakan untuk menggabungkan fragmen DNA dan memasukkannya ke dalam vektor—molekul DNA pembawa—untuk direplikasi di dalam organisme inang, biasanya bakteri. Hal ini memungkinkan para ilmuwan untuk menghasilkan rangkaian DNA tertentu dalam jumlah besar.
Cara Kerja Ligasi dan Kloning DNA
- Mempersiapkan Sisipan dan Vektor
Fragmen DNA yang diinginkan (sisipan) dan vektor (biasanya plasmid) dipotong dengan enzim restriksi. Hal ini menciptakan ujung lengket yang saling melengkapi—overhang pendek beruntai tunggal yang dapat berpasangan satu sama lain.
- Ligasi
Sisipan potongan dan vektor dicampur bersama dengan DNA ligase, suatu enzim yang menyegel tulang punggung gula-fosfat DNA. Ujung lengket komplementer sejajar, dan ligase membentuk ikatan kovalen, menyatukan sisipan secara permanen ke dalam vektor.
- Transformasi
Plasmid yang telah diikat dimasukkan ke dalam sel bakteri yang kompeten melalui proses yang disebut transformasi. Hal ini sering kali dicapai melalui sengatan panas atau elektroporasi, yang membuat membran bakteri dapat ditembus DNA untuk sementara.
- Seleksi
Bakteri yang ditransformasi ditempelkan pada agar-agar yang mengandung antibiotik. Plasmid membawa gen resistensi antibiotik, sehingga hanya bakteri yang memakan plasmid tersebut yang bertahan. Hal ini menciptakan koloni, masing-masing berasal dari satu sel yang mengandung DNA hasil kloning.
- Pemutaran
Koloni disaring oleh PCR koloni atau pencernaan restriksi untuk memastikan koloni berisi sisipan yang benar. Koloni positif ditumbuhkan dalam kultur cair untuk menghasilkan plasmid yang diinginkan dalam jumlah besar.
Protokol Ligasi Praktis
Hitung rasio molar sisipan:vektor yang optimal menggunakan rumus: massa sisipan (ng) = (massa vektor (ng) × ukuran sisipan (kb) / ukuran vektor (kb)) × rasio yang diinginkan. Untuk kloning standar, gunakan rasio molar sisipan:vektor 3:1. Siapkan reaksi ligasi 10 µL: 50 ng vektor linier, massa sisipan yang dihitung, 1 µL buffer ligase DNA 10× T4 (mengandung ATP), 1 µL ligase DNA T4 (400 U/µL), dan air hingga 10 µL. Sertakan dua kontrol: ligasi khusus vektor (tanpa sisipan) untuk mengukur latar belakang dari ligasi mandiri, dan kontrol tanpa ligase. Inkubasi pada suhu 16°C selama 1–2 jam atau pada suhu 4°C semalaman untuk efisiensi maksimum. Untuk ligasi ujung tumpul, gunakan 1 μL ligase dan inkubasi pada suhu 16°C selama 16 jam. Setelah ligasi, ubah 2–5 µL menjadi 50 µL sel E. coli yang kompeten dengan kejutan panas: inkubasi dalam es selama 30 menit, panaskan pada suhu 42°C selama 45 detik, kembali ke dalam es selama 2 menit, tambahkan 950 µL media SOC, dan inkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam sambil dikocok. Letakkan 100 µL pada LB-agar dengan antibiotik yang sesuai dan, jika menggunakan skrining biru-putih, tambahkan 40 µL X-gal (20 mg/mL) dan 40 µL IPTG (100 mM). Koloni berwarna putih menunjukkan keberhasilan penyisipan (gen lacZ terganggu), sedangkan koloni biru mengandung vektor self-ligated. Ligasi yang baik akan menghasilkan koloni 10–100× lebih banyak dibandingkan kontrol vektor saja, dengan >70% koloni putih.
Aplikasi Dunia Nyata
Saat mengkloning gen GFP 0,8 kb menjadi pUC19 (2,7 kb) dengan rasio molar 3:1, ligasi menghasilkan ~200 koloni pada pelat ampisilin-X-gal. Dari jumlah tersebut, 165 (82%) berkulit putih. PCR koloni pada 10 koloni putih mengkonfirmasi sisipan GFP di 10 koloni, menunjukkan ligasi dan penyaringan yang efisien.
