Uji imunosorben terkait-enzim (ELISA) adalah immunoassay berbasis pelat yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur protein spesifik, antibodi, hormon, dan molekul lainnya. Ini menggabungkan spesifisitas antibodi dengan sensitivitas deteksi berbasis enzim.
Cara Kerja ELISA
- Pelapisan
Pelat mikrotiter dilapisi dengan antigen atau antibodi penangkap. Molekul target berikatan dengan permukaan melalui adsorpsi pasif. Piring diinkubasi semalaman dan kemudian dicuci untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat.
- Pemblokiran
Larutan pemblokiran yang mengandung protein yang tidak relevan seperti BSA atau kasein ditambahkan ke dalam sumur. Ini mencakup semua tempat pengikatan yang tersisa pada permukaan pelat, mencegah pengikatan non-spesifik pada langkah selanjutnya.
- Deteksi Antibodi
Antibodi pendeteksi yang terkonjugasi dengan enzim—paling umum horseradish peroxidase (HRP) atau alkalinephosphatese (AP)—ditambahkan. Dalam ELISA sandwich, antibodi primer mengikat target, dan antibodi sekunder terkait-enzim mengikat antibodi primer.
- Pembangkitan Sinyal
Substrat untuk enzim ditambahkan. Enzim mengubah substrat menjadi produk berwarna, berpendar, atau berpendar. Reaksi dibiarkan berlangsung selama waktu tertentu dan kemudian dihentikan.
- Pengukuran
Sinyal diukur menggunakan pembaca pelat. Intensitas sinyal sebanding dengan jumlah molekul target dalam sampel. Kurva standar yang menggunakan konsentrasi yang diketahui memungkinkan kuantifikasi.
- Format ELISA
- ELISA langsung: Antigen dilapisi, dan antibodi terkait enzim mendeteksinya secara langsung.
- ELISA tidak langsung: Antigen dilapisi, antibodi primer berikatan, dan antibodi sekunder terkait-enzim mendeteksinya.
- Sandwich ELISA: Antibodi penangkap dilapisi, antigen berikatan, dan antibodi pendeteksi melengkapi sandwich.
- ELISA Kompetitif: Sinyal menurun seiring dengan meningkatnya konsentrasi target.
Protokol ELISA Sandwich Praktis
Lapisi pelat mikrotiter berikatan tinggi 96 lubang dengan 100 µL/sumur antibodi penangkap yang diencerkan dalam buffer pelapis (0,1 M buffer karbonat-bikarbonat pH 9,6) pada konsentrasi 1–5 µg/mL. Inkubasi semalaman pada suhu 4°C. Cuci plate sebanyak 3 kali dengan 300 µL/well PBST (PBS + 0,05% Tween-20) menggunakan plate washer atau pipet multisaluran. Blokir setiap sumur dengan 200 µL buffer pemblokiran (PBST yang mengandung 3% BSA atau 5% susu kering tanpa lemak) selama 1 jam pada suhu kamar. Cuci 3 kali. Tambahkan 100 µL/well standar (pengenceran serial protein target, biasanya 7 konsentrasi mulai dari 1000 pg/mL hingga 15 pg/mL) dan sampel, masing-masing dalam rangkap dua. Inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Cuci 5 kali. Tambahkan 100 µL/well antibodi pendeteksi (biotinilasi atau terkonjugasi enzim secara langsung) pada konsentrasi yang dioptimalkan (biasanya 0,5–2 µg/mL). Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Cuci 5 kali. Jika menggunakan antibodi pendeteksi biotinilasi, tambahkan 100 µL/sumur streptavidin-HRP (1:2000) selama 30 menit dan cuci 5 kali. Tambahkan 100 µL/sumur larutan substrat TMB dan inkubasi dalam tempat gelap selama 15–30 menit. Hentikan reaksi dengan 50 µL/sumur 2N H2SO4. Ukur serapan pada 450 nm dengan pembaca plat dalam waktu 30 menit. Hasilkan kurva standar dengan memplot serapan vs. konsentrasi log dan sesuaikan dengan model logistik 4 parameter (4PL) atau 5 parameter. Hitung konsentrasi sampel dengan melakukan interpolasi dari kurva standar. Kurva yang dapat diterima memiliki R² > 0,98 dan konsentrasi standar yang dihitung kembali dalam kisaran 70–130% dari nilai yang diharapkan.
Aplikasi Dunia Nyata
ELISA sandwich untuk TNFα manusia dalam serum pasien menggunakan antibodi penangkap monoklonal dan antibodi pendeteksi poliklonal. Pengujian ini memiliki rentang deteksi 15–1000 pg/mL dengan batas kuantifikasi 20 pg/mL. Serum dari pasien rheumatoid arthritis menunjukkan kadar TNFα sebesar 85 ± 32 pg/mL (n = 24) dibandingkan dengan 12 ± 7 pg/mL pada kontrol yang sehat, hal ini menegaskan TNFα sebagai biomarker peradangan dan mendukung keputusan terapi anti-TNFα.
