Epigenomik mempelajari pola metilasi DNA, modifikasi histon, dan aksesibilitas kromatin di seluruh genom. Dua teknik epigenomik yang paling banyak digunakan adalah ATAC-seq dan sekuensing bisulfit.
ATAC-Seq
ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) memetakan daerah kromatin terbuka — DNA yang tidak terbungkus nukleosom tempat faktor transkripsi dan protein regulatorik lainnya berikatan. Ini menggunakan transposase Tn5 hiperaktif, yang secara simultan memfragmentasi DNA dan menyisipkan adapter sekuensing ke dalam daerah kromatin yang dapat diakses.
Protokolnya sangat sederhana:
- Kumpulkan 50.000 sel (segar atau kriopreservasi).
- Lisis membran sel untuk melepaskan nuklei.
- Inkubasi nuklei dengan transposase Tn5 yang dimuat dengan adapter sekuensing selama 30 menit pada 37 °C.
- Murnikan DNA yang telah ditagmentasi, amplifikasi dengan PCR menggunakan primer barcoded, dan sekuensing paired-end pada platform Illumina.
Pembacaan diselaraskan dengan genom referensi, dan puncak aktivitas transposase menunjukkan kromatin terbuka. Puncak ini diperkaya di promotor, enhancer, dan elemen regulatorik lainnya. ATAC-seq juga dapat menyimpulkan posisi nukleosom dan jejak pengikatan faktor transkripsi dari pola panjang fragmen.
Keuntungan utamanya adalah kecepatan (seluruh persiapan perpustakaan memakan waktu 2–3 jam) dan kebutuhan input yang rendah (hingga 500 sel, dan ATAC-seq sel tunggal kini rutin).
Sekuensing Bisulfit
Sekuensing bisulfit mendeteksi 5-metilsitosin (5mC) dalam DNA. Perlakuan dengan natrium bisulfit mengubah sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil (yang terbaca sebagai timin setelah PCR), sementara sitosin termetilasi tetap tidak berubah. Urutan yang dihasilkan dibandingkan dengan referensi untuk menentukan status metilasi pada resolusi basa tunggal.
Sekuensing bisulfit seluruh genom (WGBS) memberikan peta metilasi yang komprehensif tetapi mahal. Sekuensing bisulfit representasi tereduksi (RRBS) menggunakan digesti MspI untuk memperkaya daerah kaya CpG, mengurangi biaya sekuensing. Sekuensing bisulfit tertarget memperkuat daerah spesifik yang diminati, seperti pulau CpG promotor.
Pertimbangan utama:
- Perlakuan bisulfit mendegradasi DNA. Mulailah dengan 100–500 ng DNA berkualitas tinggi.
- Efisiensi konversi harus >99%. Kontrol DNA lambda yang tidak termetilasi memungkinkan penghitungan laju konversi.
- Penyelarasan memerlukan aligner yang sadar bisulfit (Bismark, BSMAP, atau BWA-meth) yang memetakan pembacaan ke referensi yang dikonversi bisulfit.
- Metilasi dilaporkan sebagai nilai-β (0 hingga 1) atau nilai-M untuk setiap situs CpG.
Kesamaan Analisis Data
Baik ATAC-seq maupun sekuensing bisulfit menghasilkan file FASTQ yang diselaraskan dengan genom referensi. Untuk ATAC-seq, pemanggilan puncak menggunakan MACS2 atau Genrich; untuk data bisulfit, pemanggilan metilasi menggunakan skrip dalam pipeline Bismark. Metrik kualitas termasuk fraksi pembacaan dalam puncak (FRiP) untuk ATAC-seq dan laju konversi bisulfit untuk data metilasi.
