La epigenómica estudia los patrones genómicos de metilación del ADN, modificaciones de histonas y accesibilidad de la cromatina. Dos de las técnicas epigenómicas más utilizadas son ATAC-seq y la secuenciación con bisulfito.

ATAC-Seq

ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) mapea regiones de cromatina abierta — ADN sin nucleosomas donde se unen los factores de transcripción y otras proteínas reguladoras. Utiliza la transposasa Tn5 hiperactiva, que simultáneamente fragmenta el ADN e inserta adaptadores de secuenciación en regiones de cromatina accesibles.

El protocolo es notablemente simple:

1. Recolecte 50,000 células (frescas o criopreservadas).
2. Lise las membranas celulares para liberar los núcleos.
3. Incube los núcleos con transposasa Tn5 cargada con adaptadores de secuenciación durante 30 minutos a 37 °C.
4. Purifique el ADN tagmentado, amplifique por PCR con cebadores con código de barras y secuencie en parejas en una plataforma Illumina.

Las lecturas se alinean al genoma de referencia, y los picos de actividad de transposasa indican cromatina abierta. Estos picos están enriquecidos en promotores, potenciadores y otros elementos reguladores. ATAC-seq también puede inferir el posicionamiento de nucleosomas y las huellas de unión de factores de transcripción a partir del patrón de longitudes de fragmentos.

Las principales ventajas son la velocidad (la preparación completa de la librería toma 2–3 horas) y los bajos requisitos de entrada (hasta 500 células, e incluso ATAC-seq unicelular es ahora rutinario).

Secuenciación con Bisulfito

La secuenciación con bisulfito detecta 5-metilcitosina (5mC) en el ADN. El tratamiento con bisulfito de sodio convierte las citosinas no metiladas en uracilo (que se lee como timina después de la PCR), mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios. La secuencia resultante se compara con una referencia para determinar el estado de metilación con resolución de una sola base.

Secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) proporciona un mapa de metilación integral pero es costosa. Secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) usa digestión con MspI para enriquecer regiones ricas en CpG, reduciendo el costo de secuenciación. Secuenciación de bisulfito dirigida amplifica regiones específicas de interés, como islas CpG de promotores.

Consideraciones clave:

• El tratamiento con bisulfito degrada el ADN. Comience con 100–500 ng de ADN de alta calidad.
• La eficiencia de conversión debe ser >99%. Los controles de ADN lambda no metilado añadidos permiten calcular la tasa de conversión.
• La alineación requiere un alineador específico para bisulfito (Bismark, BSMAP o BWA-meth) que mapee las lecturas a una referencia convertida con bisulfito.
• La metilación se reporta como valores β (0 a 1) o valores M para cada sitio CpG.

Aspectos Comunes del Análisis de Datos

Tanto ATAC-seq como la secuenciación con bisulfito producen archivos FASTQ que se alinean al genoma de referencia. Para ATAC-seq, la llamada de picos usa MACS2 o Genrich; para datos de bisulfito, la llamada de metilación usa scripts dentro del pipeline de Bismark. Las métricas de calidad incluyen la fracción de lecturas en picos (FRiP) para ATAC-seq y la tasa de conversión de bisulfito para datos de metilación.