Setelah amplifikasi PCR atau digesti restriksi, DNA harus dimurnikan dari enzim, primer, nukleotida, garam, dan komponen buffer sebelum aplikasi hilir. Dua metode terkait mencakup sebagian besar kebutuhan purifikasi.

Purifikasi PCR

Purifikasi PCR menghilangkan primer, dNTP, polimerase, dan garam dari reaksi amplifikasi. Sebagian besar kit komersial menggunakan membran silika dalam kolom spin: DNA berikatan dengan membran dengan adanya konsentrasi tinggi garam kaotropik, kontaminan melewati, dan DNA dielusi dalam buffer garam rendah (biasanya 10 mM Tris atau air).

Protokol umum: tambahkan buffer pengikat (mengandung guanidin hidroklorida atau kaotrop serupa) langsung ke reaksi PCR, muat ke kolom, sentrifugasi, cuci dengan buffer pencuci berbasis etanol, sentrifugasi lagi, dan elusi dalam 20–50 µL. Pemulihan biasanya 60–90%.

Purifikasi PCR cepat (5–10 menit) dan bekerja untuk fragmen >100 bp. Ini tidak menghilangkan primer-dimer atau produk non-spesifik dengan ukuran serupa — hanya primer berlebih dan fragmen kecil yang melewati kolom.

Ekstraksi Gel

Ekstraksi gel mengisolasi pita DNA spesifik dari gel agarosa, menghilangkan semua fragmen DNA lainnya, termasuk primer-dimer dan produk mispriming. Pita yang diinginkan dipotong di bawah sinar UV menggunakan pisau bedah bersih, dan agarosa dilarutkan dalam larutan garam kaotropik pada 50–60 °C. Agarosa yang meleleh kemudian dilewatkan melalui kolom spin silika seperti dalam purifikasi PCR.

Pertimbangan utama:

• Minimalkan waktu paparan UV untuk mencegah kerusakan DNA (gunakan UV 365 nm daripada 302 nm jika tersedia).
• Potong sedekat mungkin dengan pita untuk meminimalkan volume agarosa.
• Langkah pelarutan memerlukan buffer yang cukup — biasanya 3 volume per volume gel.
• Hasil menurun untuk fragmen >10 kb; inkubasi gel terlarut pada suhu ruang daripada di kolom meningkatkan pemulihan fragmen besar.

Pembersihan DNA dengan Presipitasi

Presipitasi etanol adalah alternatif tradisional yang tidak memerlukan kit. Tambahkan 0,1 volume 3 M natrium asetat (pH 5,2) dan 2,5 volume etanol 100% dingin, inkubasi pada −20 °C atau −80 °C, sentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 15–30 menit, cuci dengan etanol 70%, keringkan udara, dan resuspensi. Metode ini bekerja untuk semua ukuran fragmen tetapi memakan waktu lebih lama dan tidak menghilangkan dNTP seefisien kolom silika.

Kontrol Kualitas

Setelah purifikasi, ukur rasio A₂₆₀/A₂₈₀ untuk memeriksa kemurnian (idealnya 1,8–2,0). Jalankan alikuot pada gel untuk memverifikasi bahwa pita utuh dan berukuran benar. Untuk kloning, buffer elusi harus kompatibel dengan enzim hilir — elusi dalam air atau 10 mM Tris (bukan EDTA jika ligasi menyusul).