Penarikan-turun tag GST menggunakan protein fusi glutathione S-transferase (GST) yang diimobilisasi pada agarosa glutathione untuk memurnikan protein rekombinan dari sistem ekspresi atau untuk menangkap dan mengidentifikasi interaksi protein-protein dari lisat sel.
Prinsip
Protein GST 26 kDa dari Schistosoma japonicum difusikan ke protein target. GST mengikat glutathione (GSH, γ-glutamyl-sisteinil-glisin) yang diimobilisasi pada manik agarosa dengan afinitas tinggi (K_d ≈ 0,1 µM). Protein fusi ditangkap dari lisat kasar, dicuci secara ekstensif, dan dielusi dengan 10–20 mM glutathione tereduksi dalam kondisi non-denaturasi. Untuk studi interaksi, protein fusi GST terimobilisasi berfungsi sebagai umpan untuk menangkap protein interaksi dari lisat, yang kemudian diidentifikasi oleh Western blot atau spektrometri massa.
Resin Glutathione
Agarosa glutathione biasanya berupa manik agarosa ikatan-silang dengan glutathione digabungkan melalui atom sulfur. Kapasitas pengikatan adalah 5–15 mg protein fusi GST per mL resin. Glutathione tereduksi digunakan sebagai eluen kompetitif. Pengembangan awal dan equilibrasi dalam PBS atau buffer serupa (pH 7,3–8,0) diperlukan sebelum penggunaan. Manik magnetik glutathione memungkinkan penarikan-turun cepat dalam tabung mikro sentrifugasi untuk studi interaksi skala kecil.
Ekspresi dan Lisis
Protein fusi GST diekspresikan dalam strain E. coli BL21(DE3) dari vektor pGEX (GE Healthcare), yang mencakup promotor tac yang dapat diinduksi dengan IPTG. Ekspresi pada 18–25 °C semalaman meningkatkan kelarutan target yang sulit. Lisis dalam PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,3) dengan 1% Triton X-100 atau 0,1% Tween-20 mengurangi pengikatan non-spesifik. DTT (1–5 mM) mempertahankan GST dalam bentuk tereduksinya yang aktif. Inhibitor protease dan DNase/RNase meningkatkan kualitas lisat.
Protokol Pemurnian
Equilibrasi agarosa glutathione dengan PBS. Inkubasi lisat yang telah diklarifikasi dengan resin (curah: 30–60 menit, 4 °C; kolom: aliran gravitasi). Cuci dengan 20 volume PBS ditambah 0,1% Triton X-100. Elusi dengan 10 mM glutathione tereduksi dalam 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Kumpulkan fraksi 0,5 mL. Dialisis protein yang terelusi untuk menghilangkan glutathione untuk aplikasi hilir. Hilangkan tag GST dengan pemotongan trombin atau protease PreScission pada situs pengenalan yang dirancang, diikuti oleh langkah agarosa glutathione subtraktif untuk menangkap GST bebas dan fusi yang tidak terpotong.
Protokol Penarikan-Turun untuk Interaksi
Imobilisasi 50–200 µg umpan fusi GST pada 25–50 µL agarosa glutathione. Inkubasi dengan lisat sel (0,5–2 mg total protein) dalam buffer pengikatan (PBS + 0,1% NP-40) selama 1–2 jam pada 4 °C dengan rotasi. Cuci 3–5 kali dengan buffer pengikatan. Elusi dengan 2× buffer sampel SDS dan analisis dengan SDS-PAGE diikuti oleh pewarnaan Coomassie atau Western blot. Sertakan manik GST saja sebagai kontrol negatif untuk mengidentifikasi protein yang mengikat secara non-spesifik ke GST atau resin. Pra-inkubasi kompetitor glutathione (10 mM) menunjukkan kompetisi spesifik.
Kelebihan dan Keterbatasan
Tag GST sering meningkatkan ekspresi dan kelarutan mitra fusinya, menjadikannya berharga untuk protein yang sulit. Elusi glutathione bersifat ringan dan mempertahankan aktivitas protein. Ukuran besar (26 kDa) dapat, bagaimanapun, mengganggu beberapa uji fungsional, mengharuskan penghilangan tag. Dimerisasi GST dapat menyebabkan oligomerisasi protein fusi yang tidak diinginkan. Tag ini ideal untuk studi interaksi penangkapan afinitas tetapi kurang sesuai jika penambahan 26 kDa pada berat molekul bermasalah untuk kerja struktural.
