Kromatografi afinitas logam terimobilisasi memurnikan protein rekombinan bertanda polihistidina dengan mengikat ion logam transisi terimobilisasi (Ni²⁺ atau Co²⁺) melalui cincin imidazol rantai samping histidina dan elusi dengan imidazol atau pH rendah.
Prinsip
Tag polihistidina — biasanya 6 hingga 10 residu histidina berurutan — difusikan ke ujung N atau C dari protein rekombinan. Rantai samping imidazol histidina berkoordinasi dengan ion logam divalen terkelat (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) yang diimobilisasi pada pendukung kromatografi melalui kelator asam nitrilotriasetat atau asam iminodiasetat. Ni-NTA (asam nitrilotriasetat) menyediakan empat situs koordinasi untuk ion Ni²⁺, meninggalkan dua situs yang tersedia untuk pengikatan histidina. Interaksi bersifat reversibel: imidazol (20–500 mM) secara kompetitif menggantikan tag histidina, atau pH rendah (4,5–5,5) memprotonasi rantai samping histidina, mengganggu koordinasi logam.
Jenis Resin
Ni-NTA agarosa (Qiagen, Thermo Fisher) adalah resin IMAC yang paling banyak digunakan. Kapasitas pengikatan biasanya 5–10 mg protein bertanda 6×His per mL resin yang diendapkan. Ni-Sepharose (GE Healthcare) menawarkan laju alir lebih tinggi untuk aplikasi FPLC. TALON (Clontech/TaKaRa) menggunakan resin Co²⁺-karboksimetilaspartat, memberikan spesifisitas lebih tinggi dengan pengikatan non-spesifik lebih rendah daripada Ni-NTA, dengan konsekuensi kapasitas lebih rendah. Manik magnetik (Dynabeads His-Tag, MagnaHis) memungkinkan pemurnian curah dari volume kecil. Resin kapasitas tinggi (hingga 40 mg/mL) tersedia untuk pemurnian preparatif.
Buffer
Buffer lisis/pemuatan: 20–50 mM Tris atau fosfat pH 7,5–8,0, 300–500 mM NaCl (menekan interaksi ionik), 10–20 mM imidazol (mengurangi pengikatan non-spesifik). Buffer pencuci: komposisi sama dengan 20–40 mM imidazol. Buffer elusi: 200–500 mM imidazol atau gradien pH hingga 4,5. Konsentrasi NaCl sangat penting — garam rendah meningkatkan pengikatan non-spesifik protein asam. Aditif seperti 1 mM DTT atau TCEP mencegah oksidasi sistein permukaan. Untuk protein membran, deterjen 0,1–1% yang kompatibel dengan IMAC (DDM, CHAPS, digitonin) dapat disertakan.
Protokol
Lisis sel dalam buffer lisis dengan inhibitor protease. Klarifikasi dengan sentrifugasi (20.000 g, 30 menit) dan filtrasi (0,45 µm). Equilibrasi resin dengan 5 volume buffer lisis. Inkubasi lisat yang telah diklarifikasi dengan resin (mode curah: 30 menit rotasi pada 4 °C, atau mode kolom: muat pada 0,5–1 mL/menit). Cuci dengan 10–20 volume kolom buffer pencuci hingga baseline UV stabil. Elusi dengan 5–10 volume buffer elusi, kumpulkan fraksi. Analisis fraksi dengan SDS-PAGE dan Western blot atau uji Bradford.
Penempatan dan Pemotongan Tag
Tag 6×His dapat ditempatkan di kedua ujung. Tag N-terminal lebih umum dan menghasilkan ekspresi lebih tinggi di E. coli, tetapi tag C-terminal mengurangi risiko mempengaruhi sekuens sinyal N-terminal. Tag dapat dihilangkan dengan menggabungkan situs pemotongan protease TEV, trombin, atau Factor Xa antara tag dan protein. Pemotongan dilakukan setelah elusi, diikuti oleh langkah IMAC subtraktif untuk menghilangkan tag yang terpotong dan protein yang tidak terpotong.
Aplikasi
His-tag/IMAC adalah metode pemurnian protein yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Metode ini bekerja untuk protein larut yang diekspresikan di E. coli, ragi, sel serangga, dan sel mamalia. Metode ini juga memurnikan protein membran yang dilarutkan dalam deterjen, protein badan inklusi yang dimurnikan dalam kondisi denaturasi (8 M urea atau 6 M guanidin-HCl), dan kompleks protein melalui penandaan berurutan dari mitra interaksi (ko-IMAC). Ukuran tag yang kecil jarang mengganggu fungsi protein, menjadikannya ideal untuk penangkapan afinitas, studi struktural, dan uji enzimatik.
