PCR Multipleks adalah variasi PCR standar yang memperkuat beberapa target DNA dalam satu reaksi. Dengan menyertakan beberapa pasang primer, ilmuwan dapat mendeteksi dan menganalisis beberapa gen atau rangkaian sekaligus, sehingga menghemat waktu, reagen, dan bahan sampel.
Cara Kerja PCR Multipleks
- Desain Dasar
Beberapa pasangan primer dirancang, masing-masing spesifik untuk urutan target yang berbeda. Primer harus memiliki suhu leleh yang sama agar dapat bekerja pada kondisi siklus termal yang sama. Setiap amplikon dirancang dengan ukuran berbeda sehingga produk dapat dibedakan dengan elektroforesis gel.
- Optimasi Reaksi
Menyeimbangkan konsentrasi primer sangatlah penting. Primer yang dapat melakukan amplifikasi secara efisien mungkin perlu dikurangi, sedangkan primer yang lemah mungkin perlu ditingkatkan. Konsentrasi magnesium dan suhu anil dioptimalkan untuk memastikan semua target teramplifikasi tanpa menghasilkan dimer primer atau produk non-spesifik.
- Amplifikasi
Reaksi mengalami siklus termal standar. Semua target diperkuat secara bersamaan dalam tabung yang sama. Sifat PCR yang eksponensial berarti bahwa perbedaan efisiensi yang kecil sekalipun dapat mempengaruhi jumlah relatif setiap produk.
- Analisis
Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa. Setiap target menghasilkan pita dengan ukuran spesifiknya, sehingga memungkinkan identifikasi target mana yang ada. Dalam PCR multipleks kuantitatif, probe fluoresen memungkinkan deteksi real-time dari setiap target dalam saluran warna berbeda.
- Aplikasi
PCR multipleks digunakan dalam deteksi patogen (mengidentifikasi beberapa virus atau bakteri dalam satu tes), skrining genetik, profil DNA forensik, dan genotipe. Kemampuan untuk menguji beberapa target dalam satu reaksi menjadikannya sangat berharga dalam diagnostik klinis.
Desain PCR Multipleks Praktis
Mulailah dengan memilih pasangan primer untuk setiap target menggunakan perangkat lunak seperti Primer3 atau Primer-BLAST. Pastikan semua primer memiliki suhu leleh antara 2–4°C (biasanya 58–62°C) dan kandungan GC 40–60%. Periksa kompatibilitas silang: primer tidak boleh membentuk dimer primer yang stabil satu sama lain, khususnya ujung 3’. Gunakan alat seperti AutoDimer atau modul multiplexing di Primer3 untuk mengevaluasi interaksi. Atur ukuran amplikon agar berbeda setidaknya 50–100 bp sehingga produk terselesaikan dengan jelas dengan elektroforesis gel agarosa. Untuk reaksi 4 kompleks, bidik amplikon 150, 250, 400, dan 600 bp. Siapkan campuran induk dengan 1× buffer PCR, 1,5–3 mM MgCl2 (optimalkan dengan peningkatan 0,5 mM), 200 µM setiap dNTP, 0,1–1,0 µM setiap primer (mulai dengan equimolar dan sesuaikan berdasarkan intensitas pita), 1–100 ng DNA templat, dan 1 U Taq polimerase. Jalankan gradien suhu (50–65°C) untuk menentukan suhu anil yang optimal. Evaluasi produk dengan elektroforesis gel — pita harus berbeda dengan amplifikasi nonspesifik minimal atau artefak dimer primer. Jika salah satu target memiliki amplifikasi yang buruk, tingkatkan konsentrasi primernya sambil mengurangi target yang melakukan amplifikasi berlebih.
Aplikasi Dunia Nyata
Pada panel patogen pernapasan, PCR multipleks mendeteksi SARS-CoV-2, influenza A/B, dan virus pernapasan syncytial dalam satu reaksi menggunakan empat pasangan primer dengan ukuran amplikon berbeda. Pengujian dijalankan dalam format pelat 96 sumur dengan kontrol di setiap proses. Hasilnya dapat diketahui dalam waktu 2–3 jam, sehingga memungkinkan keputusan triase dan pengobatan yang cepat selama musim flu dan wabah pandemi.
