Pengurutan generasi berikutnya (NGS) mencakup serangkaian teknologi pengurutan modern yang dapat mengurutkan jutaan fragmen DNA secara paralel, sehingga memungkinkan pengurutan seluruh genom dengan cepat dan terjangkau. Platform seperti Illumina, Ion Torrent, dan PacBio mendominasi bidang ini.
Cara Kerja NGS (Platform Illumina)
- Persiapan Perpustakaan
DNA terfragmentasi menjadi potongan-potongan kecil, biasanya 200-600 pasangan basa. Adaptor—urutan pendek yang diketahui—diikat ke kedua ujung setiap fragmen. Adaptor ini memungkinkan fragmen untuk mengikat sel aliran dan berfungsi sebagai situs utama untuk pengurutan.
- Pembuatan Klaster
Perpustakaan dimuat ke sel aliran yang permukaannya dilapisi dengan oligonukleotida komplementer. Setiap fragmen berikatan dengan sel aliran dan mengalami amplifikasi jembatan: fragmen dibengkokkan, untaian baru disintesis, dan proses berulang, menciptakan sekelompok ribuan salinan identik dari setiap fragmen.
- Urutan dengan Sintesis
Nukleotida berlabel fluoresensi dialirkan ke sel aliran satu per satu. Setiap nukleotida memiliki terminator reversibel yang memungkinkan hanya satu basa ditambahkan per siklus. Setelah setiap siklus, fluoresensi dicitrakan untuk mengidentifikasi basa mana yang ditambahkan ke setiap cluster.
- Analisis Data
Jutaan pembacaan sequencing dihasilkan. Pembacaan ini diselaraskan dengan genom referensi atau dirakit secara de novo. Alat bioinformatika mengidentifikasi varian genetik, tingkat ekspresi gen, atau modifikasi epigenetik bergantung pada aplikasinya.
- Aplikasi
NGS digunakan untuk pengurutan seluruh genom, panel gen yang ditargetkan, pengurutan RNA, analisis epigenetik, dan metagenomik, dan banyak aplikasi lainnya.
Alur Kerja Persiapan Perpustakaan NGS yang Praktis
Mulailah dengan 10–100 ng DNA genom berkualitas tinggi (A260/A280 > 1.8, A260/A230 > 2.0). Fragment DNA menggunakan sonikator Covaris atau fragmentasi enzimatik untuk mencapai ukuran target 200–600 bp. Lakukan perbaikan ujung untuk menghasilkan ujung tumpul, diikuti dengan A-tailing (penambahan satu adenosin pada ujung 3’) menggunakan fragmen Klenow. Adaptor yang kompatibel dengan Ligate Illumina yang berisi overhang 5’ T ke fragmen ekor A menggunakan ligase DNA T4. Purifikasi produk ligasi menggunakan manik-manik AMPure XP dengan rasio manik-ke-sampel 0,8× untuk menghilangkan adaptor yang tidak diikat. Perkuat perpustakaan yang diikat adaptor dengan PCR selama 8-12 siklus menggunakan primer yang melengkapi rangkaian adaptor; menyertakan kode batang indeks ganda unik untuk multiplexing sampel. Bersihkan produk PCR dengan manik AMPure XP dengan rasio 0,8×. Menilai kualitas dan kuantitas perpustakaan menggunakan Bioanalyzer atau TapeStation (distribusi ukuran yang diharapkan: 250–700 bp) dan kuantifikasi fluorometri Qubit. Normalisasikan perpustakaan menjadi 4 nM, kumpulkan secara equimolar, dan denaturasi dengan NaOH 0,2 N sebelum dimuat ke sel aliran Illumina pada 1,8 pM untuk pengurutan ujung berpasangan 2 × 150 bp. Pantau kepadatan klaster (target: 800–1.200 K/mm² untuk HiSeq 4000) dan skor Q30 (>80% untuk pengoperasian berkualitas tinggi). Demultipleks output menggunakan bcl2fastq dan menilai kualitas per basis dengan FastQC. Pangkas adaptor dan basis berkualitas rendah menggunakan Trimmomatic sebelum penyelarasan.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam genomik kanker klinis, panel NGS bertarget yang mencakup 500 gen terkait kanker digunakan untuk membuat profil biopsi tumor pasien. Persiapan perpustakaan dari 50 ng DNA FFPE menghasilkan 94% target yang tercakup pada kedalaman >100×. Analisis tersebut mengidentifikasi mutasi KRAS G12C (0,46 VAF) dan amplifikasi EGFR, yang memandu pemilihan pengobatan dengan inhibitor MEK.
