Titrasi virus sangat penting untuk mengkuantifikasi virus infeksius dalam penelitian, produksi vaksin, dan diagnostik klinis. Uji plak adalah standar emas untuk mengukur titer virus infeksius.
Prinsip Uji Plak
Ketika virus menginfeksi monolayer sel yang rentan dalam cawan kultur, ia bereplikasi dan menyebar ke sel yang berdekatan. Setelah beberapa putaran infeksi, zona lokal kematian sel (plak) menjadi terlihat. Setiap plak diasumsikan berasal dari satu partikel virus infeksius.
Prosesnya:
- Tumbuhkan monolayer konfluen dari sel yang rentan (misalnya, sel Vero untuk banyak virus) dalam plat multi-sumur.
- Infeksi monolayer dengan pengenceran serial sampel virus.
- Biarkan adsorpsi virus selama 1–2 jam dengan pengocokan berkala.
- Lapisi sel dengan medium semi-padat (agarosa, metilselulosa, atau karboksimetil selulosa) yang mencegah virus menyebar melalui medium cair, membatasi infeksi ke sel yang berdekatan dengan situs infeksi asli.
- Inkubasi selama 2–10 hari (tergantung pada virus) sampai plak terlihat.
- Fiksasi dan pewarnaan monolayer dengan crystal violet, neutral red, atau formalin. Plak muncul sebagai area jernih dengan latar belakang sel yang diwarnai.
Hitung plak dan hitung: plaque-forming units per mL (PFU/mL) = (jumlah plak) / (pengenceran × volume yang ditanam dalam mL).
Uji TCID₅₀
Uji TCID₅₀ (50% Tissue Culture Infectious Dose) adalah metode pengenceran akhir yang tidak memerlukan visualisasi plak. Pengenceran serial virus ditambahkan ke sumur replika dari plat 96-sumur yang berisi sel yang rentan. Setelah inkubasi, sumur dinilai untuk efek sitopatik (CPE). TCID₅₀ adalah pengenceran di mana 50% sumur menunjukkan CPE, dihitung dengan metode Reed–Muench atau Spearman–Kärber.
Nilai TCID₅₀/mL dapat dikonversi ke PFU/mL (kira-kira 1 PFU ≈ 0,7 unit TCID₅₀), tetapi hubungannya tidak tepat dan tergantung pada virus dan tipe sel.
Uji Fokus Fluoresen
Untuk virus yang tidak menghasilkan plak atau CPE yang jelas, protein virus dideteksi dengan imunofluoresensi. Monolayer yang terinfeksi difiksasi dan diwarnai dengan antibodi fluoresen terhadap antigen virus. Fokus fluoresen dihitung di bawah mikroskop epifluoresensi, memberikan focus-forming units per mL (FFU/mL).
Uji Hemaglutinasi
Beberapa virus (influenza, paramyxovirus) memiliki protein hemaglutinin yang mengikat dan mengaglutinasi sel darah merah. Pengenceran serial virus dicampur dengan RBC dalam plat V-bottom. Titer hemaglutinasi adalah pengenceran tertinggi yang masih menyebabkan aglutinasi (kisi difus RBC yang tidak mengendap menjadi tombol). Uji HA cepat dan murah tetapi mengukur total partikel virus, bukan yang infeksius.
