La titulación viral es esencial para cuantificar virus infecciosos en investigación, producción de vacunas y diagnóstico clínico. El ensayo de placa es el estándar de oro para medir el título viral infeccioso.
Principio del Ensayo de Placa
Cuando un virus infecta una monocapa de células susceptibles en una placa de cultivo, se replica y se propaga a las células adyacentes. Después de varias rondas de infección, una zona localizada de muerte celular (una placa) se vuelve visible. Se asume que cada placa se origina de una sola partícula viral infecciosa.
El proceso:
- Cultive una monocapa confluente de células susceptibles (ej., células Vero para muchos virus) en una placa multipocillo.
- Infecte la monocapa con diluciones seriadas de la muestra viral.
- Permita la adsorción del virus durante 1–2 horas con balanceo periódico.
- Cubra las células con un medio semisólido (agarosa, metilcelulosa o carboximetilcelulosa) que evite que el virus se propague a través del medio líquido, limitando la infección a las células adyacentes al sitio de infección original.
- Incube durante 2–10 días (dependiendo del virus) hasta que las placas sean visibles.
- Fije y tiña la monocapa con violeta de cristal, rojo neutro o formalina. Las placas aparecen como áreas claras contra un fondo de células teñidas.
Cuente las placas y calcule: unidades formadoras de placa por mL (UFP/mL) = (número de placas) / (dilución × volumen sembrado en mL).
Ensayo de DICT₅₀
El ensayo de DICT₅₀ (Dosis Infectiva de Cultivo de Tejido 50%) es un método de dilución de punto final que no requiere visualización de placas. Se añaden diluciones seriadas del virus a pocillos réplica de una placa de 96 pocillos que contiene células susceptibles. Después de la incubación, los pocillos se evalúan para efecto citopático (ECP). La DICT₅₀ es la dilución a la cual el 50% de los pocillos muestran ECP, calculada por el método de Reed-Muench o Spearman-Kärber.
Los valores de DICT₅₀/mL pueden convertirse a UFP/mL (aproximadamente 1 UFP ≈ 0.7 unidades DICT₅₀), pero la relación no es exacta y depende del virus y el tipo celular.
Ensayo de Focos Fluorescentes
Para virus que no producen placas claras o ECP, las proteínas virales se detectan mediante inmunofluorescencia. La monocapa infectada se fija y se tiñe con anticuerpos fluorescentes contra un antígeno viral. Los focos fluorescentes se cuentan bajo un microscopio de epifluorescencia, dando unidades formadoras de focos por mL (UFF/mL).
Ensayo de Hemaglutinación
Algunos virus (influenza, paramixovirus) tienen proteínas hemaglutininas que se unen y aglutinan glóbulos rojos. Se mezclan diluciones seriadas del virus con glóbulos rojos en una placa de fondo en V. El título de hemaglutinación es la dilución más alta que todavía causa aglutinación (una red difusa de glóbulos rojos que no se sedimenta en un botón). El ensayo HA es rápido y económico pero mide partículas virales totales, no las infecciosas.
