Ikhtisar
Identifikasi protein dengan spektrometri massa adalah landasan proteomik. Alur kerja mendasarnya melibatkan pencernaan protein menjadi peptida menggunakan protease seperti trypsin, mengukur massa peptida utuh (MS1), dan kemudian memecah peptida terpilih untuk menghasilkan spektrum massa tandem (MS/MS) yang mengungkapkan urutan asam aminonya. Spektrum yang dihasilkan dicocokkan dengan spektrum teoritis yang berasal dari database urutan protein untuk menetapkan identitas. Pendekatan bottom-up atau shotgun ini sangat terukur dan dapat mengidentifikasi ribuan protein dari campuran kompleks dalam satu percobaan.
Metode
Sidik jari massa peptida (PMF) mengidentifikasi protein dengan mencocokkan daftar massa peptida yang diukur secara eksperimental dengan massa peptida teoretis yang dihitung dari database. PMF berfungsi paling baik untuk campuran protein sederhana atau protein murni yang dipisahkan dengan teknik seperti SDS-PAGE. Identifikasi Tandem MS (MS/MS) memecah peptida individu untuk menghasilkan spektrum yang informatif. Mesin pencari membandingkan rangkaian ion fragmen yang diamati – terutama ion b dan y – dengan rangkaian prediksi dari kandidat peptida. Pengurutan de novo menyimpulkan rangkaian peptida langsung dari spektrum ketika tidak ada database yang cocok, menggunakan perbedaan massa antara ion fragmen yang berurutan untuk memperoleh rangkaian tersebut.
Protokol Praktis
Alur kerja identifikasi protein pada umumnya dimulai dengan campuran protein, seperti kompleks imunopresipitasi, pita gel SDS-PAGE, atau fraksi elektroforesis gel kapiler. Protein direduksi dengan 10 mM dithiothreitol (DTT) pada suhu 56°C selama 30 menit, dialkilasi dengan 55 mM iodoacetamide dalam gelap selama 30 menit, dan dicerna semalaman dengan trypsin pada rasio enzim-substrat 1:50 pada 37°C. Peptida yang dihasilkan dihilangkan garamnya menggunakan C18 ZipTips dan dimuat ke sistem nanoLC yang digabungkan ke spektrometer massa Orbitrap. Instrumen beroperasi dalam mode akuisisi yang bergantung pada data: pemindaian MS1 penuh dari 350–1.600 m/z pada resolusi 70.000 mengidentifikasi 15 ion prekursor paling kuat, yang secara berurutan diisolasi dan difragmentasi oleh disosiasi tumbukan berenergi lebih tinggi (HCD) pada 27% energi tumbukan yang dinormalisasi untuk menghasilkan spektrum MS/MS. Spektrum fragmen dicari berdasarkan database protein menggunakan Mascot atau SEQUEST. Setiap kecocokan spektrum peptida dinilai berdasarkan korelasi antara ion fragmen eksperimental dan seri ion b dan y teoretis. Pencarian umpan target memperkirakan FDR, dan kecocokan disaring pada FDR 1% pada tingkat peptida dan protein. Pengelompokan protein meruntuhkan peptida yang memetakan ke banyak protein berdasarkan kekikiran. Contoh penerapan di dunia nyata: identifikasi komposisi kompleks pori nuklir manusia melalui fraksinasi biokimia dan spektrometri massa mengungkapkan lebih dari 30 nukleoporin, banyak di antaranya yang sebelumnya tidak terkarakterisasi, memberikan gambaran molekuler yang komprehensif tentang transportasi nuklir. Penerapan lainnya adalah identifikasi bakteri dengan MALDI-TOF MS dalam mikrobiologi klinis, di mana profil protein ribosom berfungsi sebagai sidik jari taksonomi untuk identifikasi tingkat spesies dalam hitungan menit, bukan hitungan hari.
Aplikasi
Identifikasi protein diterapkan di seluruh biologi molekuler dan penelitian klinis. Hal ini mengonfirmasi identitas protein murni yang diperoleh melalui ekstraksi dan pemurnian protein, mengkarakterisasi komponen eksperimen proteomik dan spektrometri massa, dan mengidentifikasi kompleks protein yang diko-purifikasi dengan protein umpan. Dalam mikrobiologi, ini digunakan untuk mengidentifikasi spesies bakteri melalui proteotipe berbasis spektrometri massa, yang melengkapi pendekatan genom.
