RNA interference (RNAi) adalah mekanisme alami di mana molekul RNA kecil membungkam ekspresi gen dengan menargetkan mRNA komplementer untuk degradasi atau represi translasi. Ini adalah salah satu alat paling kuat untuk genomik fungsional.
Mekanisme
Jalur RNAi dimulai dengan RNA untai ganda (dsRNA) yang dibelah oleh enzim Dicer menjadi small interfering RNAs (siRNAs) sepanjang 21–23 nukleotida. siRNA ini dimuat ke dalam RNA-induced silencing complex (RISC), di mana untai panduan dipertahankan dan untai penumpang dibuang. Untai panduan berpasangan dengan mRNA komplementer, dan Argonaute-2 (Ago2), komponen katalitik RISC, membelah mRNA, mencegah translasi.
MikroRNA endogen (miRNA) mengikuti jalur yang serupa tetapi berasal dari prekursor jepit rambut (pri-miRNA → pre-miRNA → miRNA matang). Sebagian besar miRNA berikatan dengan komplementaritas tidak sempurna ke 3′ UTR dari mRNA target, menyebabkan represi translasi daripada pembelahan.
Alat RNAi Eksperimental
- siRNA sintetis: dupleks dsRNA 21 bp dengan overhang 2 nt. Ditransfeksikan langsung ke sel. Efektif selama 3–7 hari. Pendekatan paling umum untuk knockdown sementara.
- shRNA (short hairpin RNA): diekspresikan dari plasmid atau vektor virus. Jepit rambut diproses oleh Dicer menjadi siRNA. shRNA dapat diintegrasikan secara stabil menggunakan vektor lentiviral, memungkinkan knockdown jangka panjang dan pembuatan garis sel stabil.
- Mimetik dan inhibitor miRNA: RNA sintetis yang meniru miRNA endogen (mimetik) atau memblokirnya (antagomir, probe LNA). Digunakan untuk mempelajari fungsi miRNA spesifik.
Pertimbangan Desain
Desain siRNA yang efektif memerlukan:
- Menargetkan daerah pengkode atau 3′ UTR dari gen
- Menghindari kecocokan di luar target (periksa dengan BLAST)
- Kandungan GC antara 35–55%
- Menghindari pengulangan internal dan struktur sekunder
Beberapa siRNA per target direkomendasikan. Sertakan kontrol siRNA non-target (scrambled) untuk membedakan efek spesifik dari non-spesifik. Kontrol positif (misalnya, siRNA melawan gen housekeeping) mengonfirmasi bahwa transfeksi dan mesin RNAi berfungsi.
Keterbatasan
- Efek di luar target: siRNA dapat membungkam gen yang tidak diinginkan melalui komplementaritas parsial, terutama di daerah benih (posisi 2–8).
- Respons interferon: dsRNA panjang (>30 bp) memicu respons imun bawaan. Gunakan siRNA sintetis yang dimurnikan untuk menghindari ini.
- Daya tahan: siRNA diencerkan oleh pembelahan sel. Untuk eksperimen jangka panjang, gunakan shRNA atau beberapa transfeksi.
- Knockdown tidak lengkap: protein sisa mungkin masih fungsional. Konfirmasi knockdown pada tingkat mRNA (qPCR) dan protein (Western blot).
