Ikhtisar
Urutan RNA (RNA-seq) telah menjadi metode standar untuk mengukur ekspresi gen, menggantikan pendekatan berbasis hibridisasi sebelumnya. Dengan mengubah molekul RNA menjadi perpustakaan cDNA dan mengurutkan jutaan fragmen, RNA-seq memberikan identitas dan kelimpahan transkrip dalam sampel biologis. Tidak seperti microarray, RNA-seq dapat mendeteksi transkrip baru, varian sambatan, dan RNA non-coding tanpa desain probe sebelumnya. Teknik ini memberikan rentang dinamis yang mencakup beberapa kali lipat dan resolusi basis tunggal. Data RNA-seq mendukung sebagian besar studi transkriptomik modern, mulai dari organisme model hingga spesimen klinis.
Konsep Utama
Jalur analisis RNA-seq dimulai dengan pembacaan sekuensing mentah, yang menjalani kontrol kualitas (FastQC), pemangkasan adaptor (Trimmomatic atau Cutadapt), dan penyelarasan ke genom referensi menggunakan penyelaras splice-aware seperti STAR atau HISAT2. Kuantifikasi pada tingkat gen atau transkrip dilakukan dengan alat seperti featureCounts, RSEM, atau Salmon. Nilai ekspresi dinormalisasi sebagai FPKM, RPKM, atau TPM untuk memperhitungkan kedalaman pengurutan dan panjang transkrip. Deteksi penyambungan alternatif dan transkrip baru memerlukan alat khusus seperti Kancing Manset atau StringTie, yang menyusun transkrip dari pembacaan yang selaras. Metrik kualitas mencakup kecepatan pemetaan, distribusi baca di seluruh fitur gen, dan analisis saturasi.
Aplikasi
RNA-seq diterapkan di hampir semua bidang biologi. Ini memprofilkan perubahan ekspresi gen pada penyakit versus jaringan sehat, mengidentifikasi biomarker untuk subtipe kanker, dan melacak program ekspresi gen perkembangan. Dalam mikrobiologi, RNA-seq mengungkapkan respons transkripsional terhadap antibiotik dan tekanan lingkungan. Teknik ini dibuat langsung berdasarkan metode pengurutan RNA dan sering kali diintegrasikan dengan alur kerja pengurutan generasi berikutnya. RNA-seq juga memungkinkan penemuan struktur dan tipe RNA baru, termasuk RNA non-coding panjang dan RNA sirkular, sehingga memperluas pemahaman kita tentang kompleksitas transkriptome.
Protokol Praktis
Pipa RNA-seq massal standar dimulai dengan file FASTQ mentah dari sequencer. Pertama, jalankan FastQC untuk menilai metrik kualitas termasuk skor kualitas per basis, konten GC, kontaminasi adaptor, dan urutan yang terlalu terwakili. Pangkas basis berkualitas rendah dan adaptor sisa dengan Trimmomatic atau Cutadapt: perintah umumnya adalah trimmomatic PE sample_R1.fastq sample_R2.fastq -baseout trimmed.fq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36. Untuk penyelarasan splice-aware, STAR memerlukan indeks genom yang dibuat dengan STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles genome.fa --sjdbGTFfile annotation.gtf. Sejajarkan bacaan dengan STAR --runThreadN 8 --genomeDir star_index --readFilesIn trimmed_R1.fastq trimmed_R2.fastq --outSAMtype BAM SortedByCoordinate. Kuantifikasi pada tingkat gen menggunakan featureCounts -a annotation.gtf -o counts.txt -t exon -g gene_id aligned.bam, yang menghasilkan matriks hitungan dengan baris sebagai gen dan kolom sebagai sampel. Untuk kuantifikasi tingkat transkrip, Salmon memberikan estimasi bebas penyelarasan: salmon quant -i salmon_index -l A -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o quant_output. Metrik kendali mutu yang akan dilaporkan mencakup persentase pembacaan yang dipetakan secara unik (idealnya >80%), laju pemetaan ke wilayah eksonik, bias 3′, dan tingkat kontaminasi rRNA. Menilai kompleksitas perpustakaan dengan preseq untuk memperkirakan apakah pengurutan yang lebih dalam akan menghasilkan gen tambahan yang terdeteksi. Matriks hitungan akhir dimuat ke R untuk analisis ekspresi diferensial dengan DESeq2 atau edgeR. Untuk kuantifikasi bebas penyelarasan, pendekatan pemetaan kuasi Salmon melewati langkah penyelarasan sepenuhnya, sehingga memberikan pemrosesan yang lebih cepat dengan tetap menjaga akurasi: salmon quant -i Transcript_index -l A -1 reads_R1.fastq -2 reads_R2.fastq --validateMappings -o quant. Tanda --validateMappings meningkatkan sensitivitas untuk transkrip baru.
