Ikhtisar
Pengurutan RNA kecil menargetkan kelas molekul RNA non-coding pendek – biasanya panjangnya 18–35 nukleotida – yang memainkan peran pengaturan penting dalam ekspresi gen. Ini termasuk mikroRNA (miRNA), RNA pengganggu kecil (siRNA), dan RNA yang berinteraksi dengan Piwi (piRNA). Meskipun ukurannya kecil, molekul-molekul ini memberikan kontrol yang kuat terhadap stabilitas mRNA, translasi, keadaan kromatin, dan pembungkaman transposon. RNA-seq kecil memerlukan persiapan perpustakaan khusus untuk menangkap fragmen pendek dan alat bioinformatika yang berbeda untuk anotasi dan kuantifikasi yang akurat.
Metode
Persiapan perpustakaan RNA-seq kecil melibatkan pemilihan ukuran RNA (biasanya dengan eksisi gel atau pemurnian berbasis manik), ligasi adaptor 3’ dan 5’, transkripsi terbalik, dan amplifikasi PCR. Karena RNA kecil lebih pendek dari panjang baca, maka RNA tersebut diurutkan seluruhnya, dan rangkaian adaptor harus dipangkas secara tepat selama prapemrosesan. Alat penyelarasan khusus (seperti miRDeep2, sRNAbench, atau ShortStack) membaca peta ke database RNA kecil yang diketahui (miRBase untuk miRNA, Rfam untuk ncRNA lainnya). Kuantifikasi memperkirakan tingkat ekspresi miRNA yang diketahui sementara deteksi miRNA baru bergantung pada karakteristik struktur prekursor jepit rambut. Analisis ekspresi diferensial mengikuti prinsip yang mirip dengan mRNA-seq tetapi dengan pertimbangan khusus untuk normalisasi karena RNA kecil memiliki distribusi panjang dan bias GC yang berbeda.
Aplikasi
Profil RNA kecil telah mengungkapkan peran pengaturan molekul-molekul ini. tanda tangan miRNA membedakan subtipe kanker dan memprediksi respons pengobatan. MiRNA yang bersirkulasi dalam darah atau serum berfungsi sebagai biomarker invasif minimal untuk penyakit termasuk kanker, penyakit kardiovaskular, dan degenerasi saraf. Analisis ini berkaitan dengan studi struktur dan tipe RNA yang lebih luas serta regulasi gen dan epigenetika, karena banyak RNA kecil yang berpartisipasi dalam putaran regulasi dengan faktor transkripsi dan pengubah epigenetik. Pemahaman biogenesis RNA kecil juga didasarkan pada konsep transkripsi dan pemrosesan RNA, khususnya peran Drosha dan Dicer dalam pematangan miRNA.
Protokol Praktis
Persiapan perpustakaan RNA-seq kecil dimulai dengan total input RNA (100–1000 ng). Pemilihan ukuran sangat penting: fragmen RNA berukuran 18–35 nt diisolasi dengan eksisi gel dari gel poliakrilamida 15% atau dengan pemurnian berbasis manik dengan manik AMPure XP pada konsentrasi PEG tertentu. Ligasi adaptor menggunakan T4 RNA ligase 2 terpotong untuk adaptor 3’ (meminimalkan sirkularisasi) dan T4 RNA ligase 1 untuk adaptor 5’. Setelah transkripsi terbalik dengan SuperScript III, cDNA diamplifikasi dengan PCR (12–15 siklus untuk menghindari amplifikasi berlebihan) dan dipilih kembali ukurannya untuk menghilangkan dimer adaptor. Untuk prapemrosesan, Cutadapt memangkas urutan adaptor dengan tepat: cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG --discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq. Tanda --discard-untrimmed menghapus pembacaan tanpa adaptor yang terdeteksi. Untuk penemuan dan kuantifikasi miRNA, miRDeep2 menyediakan pipeline yang komprehensif: jalankan mapper.pl untuk memproses pembacaan, miRDeep2.pl untuk mengidentifikasi miRNA yang dikenal dan baru terhadap miRBase, dan quantifier.pl untuk mengukur ekspresi. Saluran pipa ini memberi skor pada kandidat prekursor miRNA dengan mengevaluasi karakteristik struktur jepit rambut: skor miRDeep2 di atas 10 menunjukkan prediksi dengan tingkat keyakinan tinggi. Alat alternatif termasuk sRNAbench untuk spesies dengan anotasi miRBase yang tidak lengkap dan ShortStack untuk penemuan RNA kecil de novo tanpa genom referensi. Normalisasi data ekspresi RNA kecil memerlukan perhatian khusus; pilihannya termasuk TPM (transkrip per juta), pembacaan per juta (RPM), atau penggunaan kontrol spike-in seperti cel-miR-39 sintetis. Analisis ekspresi diferensial dapat dilakukan dengan DESeq2 pada data jumlah, tetapi estimasi faktor ukuran harus hanya menggunakan jumlah miRNA daripada total pembacaan yang dipetakan untuk menghindari bias dari RNA kecil non-miRNA yang melimpah.
