概述

选择性剪接是一种基本机制，单个基因可以产生多种 mRNA 异构体，从而极大地扩展了基因组的编码能力。近 95% 的人类多外显子基因会经历选择性剪接，产生具有不同甚至相反功能的独特蛋白质产物。包含或排除哪些外显子的选择受到严格监管且具有组织特异性。选择性剪接分析旨在识别和量化不同条件、发育阶段或疾病状态下的同种型水平差异，揭示除简单表达变化之外的额外一层基因调控。

方法

从 RNA-seq 数据中检测选择性剪接事件需要专门的计算方法。 同种型量化工具（例如 Salmon、Kallisto 或 RSEM）可估计每种已知转录本同种型的丰度。 基于事件的工具（rMATS、MAJIQ 或 SUPPA2）将剪接事件分为几类：盒式外显子跳跃、互斥外显子、替代 5’ 或 3’ 剪接位点以及内含子保留。这些工具使用映射到剪接点与外显子的读数计数矩阵，并使用配对统计模型测试显着差异。 从头剪接检测（通过 StringTie 或 Cufflinks）组装不带注释的转录本，以发现新的亚型。使用生鱼片图（来自 MISO 或 IGV）可视化拼接差异有助于解释复杂的模式。

应用程序

选择性剪接失调是许多疾病的标志。在癌症中，剪接因子经常发生突变，产生驱动增殖和转移的肿瘤特异性亚型。脊髓性肌萎缩和额颞叶痴呆等神经系统疾病直接由剪接缺陷引起。了解剪接模式有助于解释[RNA 结构和类型](/guides/rna-struct-and-types.html)，并以转录和 RNA 处理 中的概念为基础。剪接分析也与[基因调控和表观遗传学](/guides/gene-regulation-and-epigenics.html)交叉，因为染色质状态影响共转录剪接位点选择，而剪接反馈可以调节转录延伸。

实用协议

对于使用 rMATS 进行基于事件的差异剪接，请从 STAR 比对的 RNA-seq BAM 文件开始，使用“–outSAMstrandField intronMotif”标志进行剪接感知比对。准备 BAM 列表文件和 GTF 注释，然后运行 rmats.py --b1 sample1.bam,sample2.bam --b2 control1.bam,control2.bam --gtf comment.gtf --od output_dir -tpaired --readLength 150。 rMATS 可检测五种剪接事件类型：跳过外显子 (SE)、互斥外显子 (MXE)、选择性 5’ 剪接位点 (A5SS)、选择性 3’ 剪接位点 (A3SS) 和保留内含子 (RI)。结果包括每个事件的包含水平差异 (IncLevelDifference) 和错误发现率 (FDR)。关键指标是剪接百分比（PSI 或 Ψ）值，它量化了包含外显子的转录本的比例。 PSI 的范围从 0（不包括）到 1（包括），并且 ΔΨ > 0.1 且 FDR < 0.05 是常见的显着性阈值。对于没有事件分类的同种型水平量化，免对齐模式下的“Salmon”可量化转录本丰度：“salmon quant -i scriptome_index -l A -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o isoform_output”。下游，“tximport”将转录本水平估计导入到 R 中，并使用“DRIMSeq”或“satuRn”测试差异转录本的使用情况。使用“rmats2sashimiplot”可视化剪接事件，它生成显示外显子-外显子连接处的读取覆盖率的生鱼片图。当基因型数据可用时，使用“FastQTL”整合剪接 QTL (sQTL) 分析，将遗传变异与个体之间的剪接变异联系起来。