细胞凋亡是一种受调控的、能量依赖的程序性细胞死亡过程，具有独特的生化和形态学变化。没有单一的检测方法能捕捉所有方面，大多数实验使用针对不同特征的方法组合。
半胱天冬酶活性检测
半胱天冬酶是执行凋亡程序的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。Caspase-3和-7是主要的执行半胱天冬酶。
荧光底物：柔连到荧光团（AMC、AFC）的肽识别序列（caspase-3/7为DEVD）。活性半胱天冬酶切割肽段，释放荧光团。在酶标仪中测量荧光（AMC的激发/发射为355/460 nm）。该检测方法简单、定量，适用于高通量筛选。
FRET报告基因：表达由荧光蛋白对（例如，CFP–DEVD–YFP）侧翼的DEVD肽段的细胞在半胱天冬酶切割后从FRET转变为供体发射。这些报告基因允许通过显微镜或流式细胞术实时监测活细胞中的凋亡。
膜联蛋白V / 碘化丙啶
在早期凋亡中，磷脂酰丝氨酸（PS）从质膜内侧翻转到外侧。膜联蛋白V以Ca²⁺依赖性方式高亲和力结合PS。与FITC、PE或APC结合后，它标记早期凋亡细胞。
碘化丙啶（PI）是一种膜不通透性DNA染料，仅在细胞膜受损（晚期凋亡或坏死）时进入。双染色区分：
- 活细胞：Annexin V⁻/PI⁻
- 早期凋亡：Annexin V⁺/PI⁻
- 晚期凋亡：Annexin V⁺/PI⁺
- 坏死细胞：Annexin V⁻/PI⁺
通过流式细胞术或荧光显微镜进行分析。检测必须在加入PI后30分钟内完成，因为PI会随时间从细胞中泄漏。
DNA片段化
在凋亡过程中，核酸内切酶（CAD/DFF40）在核小体之间切割DNA，产生180–200 bp倍数的片段。
DNA梯状条带：提取基因组DNA，在琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色。凋亡细胞显示180 bp片段的特征性梯状模式。这是一种定性的终点检测方法，相对不敏感，需要约10⁶个细胞。
TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在片段化DNA的3’-OH末端掺入标记的dUTP。标记物（生物素、DIG或荧光团）通过显微镜或流式细胞术检测。TUNEL标记所有DNA断裂，包括坏死细胞中的断裂，因此最好与基于形态学的区分结合使用。
线粒体膜电位
线粒体膜电位（ΔΨₘ）的丧失是内在凋亡途径的标志。使用基于膜电位在线粒体中积累的荧光团：
- JC-1：在低ΔΨₘ下发绿色荧光（单体），在高ΔΨₘ下发红色荧光（J聚集体）。红/绿比值指示线粒体极化状态。
- TMRE / TMRM：带正电荷的染料，在极化线粒体中积累。红色荧光丧失指示去极化。
正确的对照
所有凋亡检测都需要阳性对照（例如，1 µM星形孢菌素处理4–6小时）和阴性对照（未处理）。检测时机很重要：半胱天冬酶活性在凋亡刺激后4–8小时达到峰值，PS暴露在6–12小时，DNA片段化在12–24小时。
