细胞周期分析定量细胞在细胞分裂周期每个阶段的比例。最常见的方法通过流式细胞术测量DNA含量。
流式细胞术DNA含量分析
细胞被固定和通透化，然后用化学计量性DNA染料染色。荧光强度与DNA含量成正比：
- G0/G1：二倍体（2N）DNA含量。
- S期：介于2N和4N之间的DNA含量（DNA合成进行中）。
- G2/M：四倍体（4N）DNA含量。
关键假设是染料与DNA的质量成正比结合。碘化丙啶（PI）是固定细胞最常用的DNA染料，但它也结合RNA。因此，RNase A或RNase T1处理步骤至关重要。
碘化丙啶方案：
- 收获1×10⁶个细胞并用PBS洗涤。
- 在70%乙醇中于−20 °C固定至少2小时（可储存数周）。
- 用PBS洗涤去除乙醇（洗涤过程中涡旋以防止结块）。
- 重悬于PI/RNase染色缓冲液（50 µg/mL PI、100 µg/mL RNase A，溶于含0.1% Triton X-100的PBS）。
- 在37 °C避光孵育30分钟。
- 通过流式细胞术分析（线性标尺，488 nm激发，>575 nm发射）。
- 以低流速收集至少10,000个事件以获得最佳CV。
数据分析
DNA含量直方图显示2N和4N处的峰值，其间是S期平台。建模软件（FlowJo、ModFit、FCS Express）将数学模型拟合到数据：
- G0/G1和G2/M峰建模为高斯分布（高质量数据CV = 2–5%）。
- S期建模为从2N到4N斜率增加的宽矩形或多项式。
- 碎片和聚集体通过碎片曲线（指数）和聚集体峰（在6N、8N等处）建模。
G0/G1峰的CV >8%表示数据质量差，细胞团块、RNase处理不完全或流速过高。
BrdU掺入
溴脱氧尿苷（BrdU）是一种胸苷类似物，在S期掺入DNA。标记（30–60分钟）后，细胞被固定、通透化，并用抗BrdU抗体染色。DNA用7-AAD或DAPI复染。双参数分析（BrdU vs. DNA含量）的流式细胞术区分：
- G0/G1：BrdU低，2N DNA。
- S期：BrdU高，中等DNA。
- G2/M：BrdU低，4N DNA。
- G0：BrdU极低，2N DNA（可通过Ki-67染色区分延长的G0与G1）。
BrdU染色需要部分DNA变性（HCl或DNase I）以将掺入的BrdU暴露给抗体，这会降低DNA完整性并可能使DNA含量直方图变宽。EdU是BrdU类似物，通过铜催化的点击化学检测，避免了变性步骤并保持了高质量的DNA含量分析。
有丝分裂指数
有丝分裂（M期）中的细胞可通过染色磷酸化组蛋白H3 Ser10（p-H3S10）来鉴定。这种修饰对有丝分裂细胞具有特异性。结合DNA含量分析，p-H3S10染色区分了有丝分裂细胞与更广泛的G2/M群体。
常见陷阱
- 双联体：两个G1期细胞一起通过激光被记录为单个G2/M事件。使用双联体区分门（FL2-A vs. FL2-W）排除它们。
- 亚二倍体（sub-G1）群体：DNA含量<2N的细胞为凋亡或坏死。如果>10%的事件为sub-G1，则培养条件可能正在诱导细胞死亡。
- 固定：甲醇固定比乙醇提供更好的DNA含量分辨率，但与某些细胞表面标记物不兼容。
