细胞同步化是将培养中所有细胞带到同一细胞周期阶段的过程。它使得无需单细胞分辨率方法即可进行细胞周期依赖性研究。

化学方法

胸苷阻断。过量胸苷（2 mM）抑制核糖核苷酸还原酶，耗尽 dCTP 库并阻止 DNA 合成。细胞在 G1/S 边界积累。单次阻断在 12–24 小时内使大多数细胞阻滞在 G1/S。双胸苷阻断（阻断 16–18 小时，释放 8–10 小时，再次阻断 16–18 小时）可在 G1/S 达到 >90% 的同步化。第二次阻断捕获在第一次释放期间通过 S 期的细胞。

通过用新鲜培养基洗去胸苷进行释放。释放后，群体同步通过 S、G2 和 M 期。由于细胞周期进展速率的自然差异，同步性在每个细胞周期后下降。

羟基脲。与胸苷类似，抑制核糖核苷酸还原酶。使用浓度为 1–2 mM，持续 12–24 小时。羟基脲的毒性低于胸苷，将细胞阻滞在 G1/S 边界，可逆性好。主要缺点是会引起 DNA 损伤（复制应激），可能干扰研究 DNA 损伤反应的实验。

诺考达唑。解聚微管，将细胞阻滞在有丝分裂中期-后期检查点（纺锤体组装检查点）。使用浓度为 50–100 ng/mL，持续 12–18 小时。有丝分裂指数可达 >90%。有丝分裂细胞变圆并从培养表面脱落，可以通过振荡收集而不需胰蛋白酶消化，这种方法称为有丝分裂振荡法。释放迅速（洗出后 30–60 分钟内细胞退出有丝分裂），但如果延长超过 18 小时，阻滞是有毒的。

秋水仙碱。作用机制与诺考达唑相似，但毒性更大，可逆性更差。使用浓度为 50–100 ng/mL。秋水仙碱更常用于细胞遗传学制备（染色体铺展）而非功能性检测。

含羞草氨酸。一种植物氨基酸，抑制 DNA 复制的起始，将细胞阻滞在 G1 晚期（而非 G1/S 边界）。使用浓度为 0.5–2 mM，持续 12–24 小时。含羞草氨酸不如胸苷常用，但其优势在于阻滞在 G1 期而非 G1/S 边界，这有助于研究早期 G1 事件。

血清饥饿

从培养基中去除血清 24–72 小时可使细胞进入 G0 期（静止期）。重新添加血清后，细胞在 G1 期重新进入细胞周期。该方法简单，广泛用于原代细胞和成纤维细胞。G0/G1 同步化效率因细胞类型而异，HEK 293 细胞受血清饥饿影响很小，而 NIH 3T3 细胞能有效阻滞。

血清饥饿会引起代谢、信号传导（mTOR、MAPK）和基因表达的全局变化，这些变化不仅限于细胞周期阻滞。在代谢或信号基线至关重要的实验中不应使用这种方法。

物理方法

有丝分裂振荡法。在诺考达唑阻断期间甚至在对数生长期，有丝分裂细胞会变圆并脱落。轻轻敲击培养瓶可将它们震落到培养基中。收集的细胞 >95% 处于有丝分裂期，可以重新接种以同步进入 G1 期。产量低（群体的 1–3%），且该方法只适用于贴壁细胞。

离心淘洗。在逆流离心机中根据细胞大小进行分离，大细胞（G2/M）沉降更快，小细胞（G1）先洗脱。该方法需要专门设备，但可在无化学扰动的情况下获得同步群体。适用于贴壁和悬浮细胞，每次运行可产生 10⁸–10⁹ 个同步化细胞。

荧光激活细胞分选（FACS）。用活细胞 DNA 染料（Hoechst 33342）染色的细胞被分选为 G1、S 和 G2/M 群体。该方法可产生高纯度群体（>99%），但分选过程会造成应激，且产量低（每小时 10⁶–10⁷ 个细胞）。

验证

必须验证同步化效率，通常使用碘化丙啶 DNA 染色和流式细胞术进行细胞周期分析。成功同步化的目标期细胞比例应 >80–90%。对于有丝分裂同步化，使用 p-H3S10 染色。

方法选择

化学方法最容易获取，但可能引入假象。物理方法避免使用化学试剂，但需要专门设备或产量较低。