共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种通过消除离焦光来提高分辨率和对比度的光学成像技术。放置在检测器前方的针孔光阑阻挡来自焦平面上下方的光线，因此只有来自焦点的光才能到达检测器。这种光学切片能力使得对厚样品进行成像和三维重建成为可能。

在共聚焦显微镜中，激光束被扩展并通过物镜聚焦到样品中的衍射极限点。焦体积中的[荧光分子](/guides/fluorescence-spectroscopy.html)被激发并发射光，由同一物镜收集。二色镜分离激发和发射光路，共轭像平面中的可变针孔光阑拒斥离焦发射光。光电倍增管或雪崩光电二极管检测信号。

光束通过振镜在样品上进行光栅扫描，逐像素构建图像。扫描速度通常在512×512像素下为0.5–4帧/秒。共振扫描仪可实现用于活细胞应用的视频速率成像。

共聚焦显微镜的横向分辨率约为0.2 µm，轴向分辨率约为0.5 µm（使用高数值孔径物镜）。分辨率取决于激发波长和物镜数值孔径。针孔直径设置为0.5–1艾里单位以平衡分辨率和信号强度。

多通道成像使用不同的激光线顺序激发多个荧光团，并通过单独的检测器或光谱通道检测发射光。常见的荧光团包括DAPI、FITC、TRITC、Cy3、Cy5和Alexa染料。光谱解混分离重叠的发射光谱。

Z轴堆叠采集收集不同焦深的一系列光学切片。最大强度投影和体渲染重建三维结构。延时成像捕获活体标本中的动态过程。FRAP（光漂白后荧光恢复）测量分子迁移率。光活化和光转换跟踪特定亚群。

应用涵盖细胞生物学、神经生物学、发育生物学和材料科学。CLSM对固定和活细胞中的细胞骨架组织、细胞内信号传导、膜动力学和亚细胞定位进行成像。在材料科学中，CLSM表征表面形貌、涂层厚度和颗粒分布。