DNA 连接和克隆是一组用于将 DNA 片段连接在一起并将其插入载体（载体 DNA 分子）中的技术，以便在宿主生物体（通常是细菌）内复制。这使得科学家能够生产大量特定的 DNA 序列。
How DNA Ligation and Cloning Works
- Preparing the Insert and Vector
感兴趣的 DNA 片段（插入片段）和载体（通常是质粒）均使用相同的限制性内切酶 进行切割。这会产生互补的粘性末端——短的单链突出端，可以彼此碱基配对。
- 结扎
切割的插入片段和载体与 DNA 连接酶混合在一起，DNA 连接酶是一种密封 DNA 糖磷酸主链的酶。互补的粘性末端对齐，连接酶形成共价键，将插入片段永久地连接到载体中。
3、转型
通过称为转化的过程将连接的质粒引入感受态细菌细胞中。这通常通过热休克或电穿孔来实现，使细菌膜暂时可渗透 DNA。
- 选型
将转化的细菌铺在含有抗生素的琼脂上。该质粒携带抗生素抗性基因，因此只有接受该质粒的细菌才能生存。这会产生菌落，每个菌落都源自含有克隆 DNA 的单个细胞。
- 筛选
通过菌落 PCR 或限制性消化来筛选菌落，以确认它们包含正确的插入片段。阳性菌落在液体培养物中生长以产生大量所需的质粒。
Practical Ligation Protocol
使用以下公式计算最佳插入片段：载体摩尔比：插入片段质量 (ng) = (载体质量 (ng) × 插入片段大小 (kb) / 向量大小 (kb)) × 所需比率。对于标准克隆，使用 3:1 的插入片段：载体摩尔比。设置 10 µL 连接反应：50 ng 线性化载体、计算的插入质量、1 µL 10× T4 DNA 连接酶缓冲液（含 ATP）、1 µL T4 DNA 连接酶（400 U/µL）和水至 10 µL。包括两个对照：用于测量自连接背景的纯载体连接（无插入）和无连接酶对照。在 16°C 下孵育 1-2 小时或在 4°C 下孵育过夜以获得最大效率。对于平端连接，使用 1 µL 连接酶并在 16°C 下孵育 16 小时。连接后，通过热休克将 2–5 µL 转化为 50 µL 感受态大肠杆菌细胞：冰上孵育 30 分钟，42°C 加热 45 秒，返回冰上 2 分钟，加入 950 µL SOC 培养基，37°C 振荡孵育 1 小时。在含有适当抗生素的 LB 琼脂上板 100 µL，如果使用蓝白斑筛选，则添加 40 µL X-gal (20 mg/mL) 和 40 µL IPTG (100 mM)。白色菌落表明插入成功（lacZ 基因被破坏），而蓝色菌落则含有自连接载体。良好的连接应产生比仅载体对照多 10-100 倍的菌落，其中白色菌落超过 70%。
实际应用
当以 3:1 摩尔比将 0.8 kb GFP 基因克隆到 pUC19 (2.7 kb) 中时，连接会在氨苄青霉素-X-gal 平板上产生约 200 个菌落。 Of these, 165 (82%) are white.对 10 个白色菌落进行的菌落 PCR 确认了所有 10 个菌落中的 GFP 插入，证明了有效的连接和筛选。
