酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种基于板的免疫测定，用于检测和定量特定蛋白质、抗体、激素和其他分子。它将抗体 的特异性与基于酶的检测的灵敏度相结合。
ELISA 的工作原理
- 涂层
微量滴定板涂有抗原或捕获抗体。目标分子通过被动吸附结合到表面。将板孵育过夜，然后洗涤以除去未结合的物质。
- 阻塞
将含有不相关蛋白质（例如 BSA 或酪蛋白）的封闭溶液添加到孔中。这覆盖了板表面上任何剩余的结合位点，防止后续步骤中的非特异性结合。
- 检测抗体
添加与酶（最常见的是辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP)）缀合的检测抗体。在夹心 ELISA 中，一抗结合靶标，酶联二抗结合一抗。
- 信号产生
添加酶的底物。该酶将底物转化为有色、荧光或发光产物。让反应进行设定的时间，然后停止。
- 测量
使用读板器测量信号。信号强度与样品中目标分子的量成正比。使用已知浓度的标准曲线可以进行定量。
- ELISA 格式
- 直接 ELISA：包被抗原，酶联抗体直接检测。
- 间接 ELISA：包被抗原，一抗结合，酶联二抗检测它。
- 夹心 ELISA：捕获抗体被包被，抗原结合，检测抗体完成夹心。
- 竞争性 ELISA：信号随着目标浓度的增加而减弱。
实用夹心 ELISA 实验方案
用 100 µL/孔的捕获抗体（在包被缓冲液（0.1 M 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 pH 9.6）中稀释，浓度为 1–5 µg/mL）包被 96 孔高结合微量滴定板。 4°C 孵育过夜。使用洗板机或多通道移液器，用 300 μL/孔的 PBST（PBS + 0.05% Tween-20）清洗板 3 次。用 200 µL 封闭缓冲液（含 3% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 PBST）在室温下封闭每个孔 1 小时。洗3次。每孔添加 100 µL 标准品（目标蛋白的连续稀释液，通常有 7 个浓度，范围从 1000 pg/mL 到 15 pg/mL）和样品，每个一式两份。室温孵育 2 小时。洗5次。添加 100 µL/孔的最佳浓度（通常为 0.5–2 µg/mL）的检测抗体（生物素化或直接酶联）。室温孵育 1 小时。洗5次。如果使用生物素化检测抗体，则添加 100 µL/孔的链霉亲和素-HRP (1:2000) 30 分钟并洗涤 5 次。每孔添加 100 µL TMB 底物溶液，并在黑暗中孵育 15-30 分钟。用 50 µL/孔的 2N H2SO4 停止反应。在 30 分钟内使用读板器测量 450 nm 处的吸光度。通过绘制吸光度与对数浓度的关系来生成标准曲线，并拟合 4 参数逻辑 (4PL) 或 5 参数逻辑模型。通过从标准曲线插值计算样品浓度。可接受的曲线具有 R² > 0.98 且反算标准浓度在预期值的 70–130% 范围内。
实际应用
针对患者血清中人 TNFα 的夹心 ELISA 使用单克隆捕获抗体和多克隆检测抗体。该测定的检测范围为 15–1000 pg/mL，定量限为 20 pg/mL。类风湿性关节炎患者的血清显示 TNFα 水平为 85 ± 32 pg/mL (n = 24)，而健康对照者为 12 ± 7 pg/mL，证实 TNFα 作为炎症的生物标志物并支持抗 TNFα 治疗决策。
