概述

功能基因组学旨在通过在全基因组范围内系统地表征基因、其产物及其相互作用的特征，来缩小基因组序列和生物功能之间的差距。结构基因组学提供了生物体 DNA 的静态蓝图，而功能基因组学则询问每个元素的作用、它何时何地活跃以及它如何参与细胞网络。该领域整合了来自转录组学、蛋白质组学和高通量扰动筛选的数据，为每个基因分配生物学功能。这种系统级视角对于理解复杂表型至关重要。

方法

多种高通量方法为功能基因组学提供支持。 功能丧失筛选 使用 RNA 干扰 (RNAi) 或 CRISPR-Cas9 文库系统地敲除基因并观察表型后果。 功能获得筛选 过表达 cDNA 文库，以识别驱动特定表型的基因。 蛋白质相互作用作图（通过酵母双杂交或亲和纯化-质谱法）构建全基因组相互作用网络。 使用 RNA-seq 或微阵列进行基因表达谱分析揭示了表明功能关系的共表达模式。通过机器学习整合不同的数据类型可以提高预测基因功能的准确性，并根据多组学证据分配注释，例如基因本体术语。

应用程序

功能基因组学推动了生命各个领域的发现。在癌症研究中，CRISPR 筛选可识别肿瘤生长所必需的基因，以及因缺失而导致耐药性 的基因。在微生物学中，全基因组适应性测定可精确定位发病机制所需的基因。农业应用包括通过结合重组 DNA 技术 和功能筛选来识别控制产量、胁迫耐受性和营养成分的基因。随着单细胞技术和体内 CRISPR 筛选，该领域不断发展，揭示天然组织环境中的基因功能，使我们更接近基因组的完整功能注释。

实用协议

对于识别转录因子结合位点的 ChIP-seq 实验，首先使用 1% 甲醛在室温下交联细胞 10 分钟，然后用甘氨酸淬灭。通过超声处理（例如 Covaris 或 Diagenode Bioruptor）将染色质剪切成 200–600 bp 片段。免疫沉淀使用 2–5 µg 靶标特异性抗体与 Protein A/G 磁珠偶联，在 4°C 下过夜。洗涤后，用蛋白酶 K 在 65°C 下逆交联 6 小时，然后通过柱净化纯化 DNA。通过末端修复、A 加尾、接头连接和 12-15 个 PCR 循环来制备文库。 Illumina 上的序列，具有单端 50 bp 读数。运行 ENCODE ATAC-seq 管道，对冷冻或新鲜细胞进行开放染色质分析：通过裂解缓冲液孵育分离细胞核，然后在 37°C 下用 Tn5 转座酶标记 30 分钟：“tagment –input 50000 cells –output tagmented.bam”。使用带条形码的引物进行 PCR 扩增 8-12 个循环并进行序列配对。对于数据分析，使用 ATAC-seq 的“–very-sensitive”或 ChIP-seq 的“BWA”将读数与“Bowtie2”对齐。使用“Picard MarkDuplicates”删除重复项。使用“MACS2”进行峰值调用：“macs2 callpeak -t adjustment.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n Sample -q 0.05”。对于 H3K4me3 等组蛋白标记，请使用带有“–broad”的宽峰模式。质量指标包括峰中读数的分数（转录因子的 FRiP > 1%，组蛋白标记的 >10%）、NSC（标准化链系数 >1.05）和 RSC（相对链相关性 >0.8）。条件之间的差异结合分析使用 R 中的“DiffBind”，并使用“HOMER”或“MEME-ChIP”测试基序富集。