GST标签下拉使用固定在谷胱甘肽琼脂糖上的谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白从表达系统中纯化重组蛋白，或从细胞裂解液中捕获和鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。

原理

来自日本血吸虫的26 kDa GST蛋白融合到靶蛋白上。GST以高亲和力（K_d ≈ 0.1 µM）结合固定在琼脂糖珠上的谷胱甘肽（GSH，γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）。融合蛋白从粗裂解液中捕获，充分洗涤，并用10–20 mM还原型谷胱甘肽在非变性条件下洗脱。对于相互作用研究，固定的GST融合蛋白作为诱饵从裂解液中捕获相互作用蛋白，然后通过Western blot或质谱鉴定。

谷胱甘肽树脂

谷胱甘肽琼脂糖通常是交联琼脂糖珠，谷胱甘肽通过硫原子偶联。结合容量为每mL树脂5–15 mg GST融合蛋白。还原型谷胱甘肽用作竞争性洗脱液。使用前需要在PBS或类似缓冲液（pH 7.3–8.0）中预溶胀和平衡。谷胱甘肽磁珠可用于微量离心管中的快速下拉，用于小规模相互作用研究。

表达与裂解

GST融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中从pGEX载体（GE Healthcare）表达，该载体包含可用IPTG诱导的tac启动子。在18–25 °C过夜表达可改善困难靶标的溶解度。在PBS（140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.3）中用1% Triton X-100或0.1% Tween-20裂解可减少非特异性结合。DTT（1–5 mM）维持GST的活性还原形式。蛋白酶抑制剂和DNase/RNase改善裂解液质量。

纯化方案

用PBS平衡谷胱甘肽琼脂糖。将澄清裂解液与树脂孵育（分批：30–60分钟，4 °C；柱：重力流）。用20倍体积PBS加0.1% Triton X-100洗涤。用10 mM还原型谷胱甘肽在50 mM Tris-HCl pH 8.0中洗脱。收集0.5 mL级分。透析洗脱的蛋白质以去除谷胱甘肽用于下游应用。通过凝血酶或PreScission蛋白酶在设计的识别位点切割去除GST标签，随后进行减法谷胱甘肽琼脂糖步骤以捕获游离GST和未切割的融合蛋白。

相互作用下拉方案

在25–50 µL谷胱甘肽琼脂糖上固定50–200 µg GST融合诱饵。与细胞裂解液（0.5–2 mg总蛋白）在结合缓冲液（PBS + 0.1% NP-40）中于4 °C旋转孵育1–2小时。用结合缓冲液洗涤3–5次。用2× SDS样品缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE后考马斯染色或Western blot分析。包括仅GST的珠子作为阴性对照，以鉴定与GST或树脂非特异性结合的蛋白质。竞争剂谷胱甘肽（10 mM）预孵育证明特异性竞争。

优势与局限

GST标签通常增强其融合伴侣的表达和溶解性，使其对困难蛋白质有价值。谷胱甘肽洗脱温和且保留蛋白质活性。大尺寸（26 kDa）可能干扰某些功能分析，需要标签去除。GST的二聚化可能导致融合蛋白的不必要寡聚化。该标签非常适合亲和捕获相互作用研究，但如果26 kDa的分子量增加对结构工作有问题，则不太适用。