高通量筛选与试验开发

高通量筛选（HTS）是一个自动化过程，测试大量化合物对生物靶标的活性，以确定药物发现或化学生物学研究的起点。精心设计的HTS活动整合了试验开发、自动化、数据分析和命中验证。

试验开发

任何HTS活动的基础是稳健、可重复的试验。试验必须测量特定的生物活性，且格式适用于自动化和微型化。生化试验使用纯化蛋白质测量酶抑制、受体结合或蛋白质-蛋白质相互作用。基于细胞的试验测量活力、报告基因表达或表型变化。

试验开发中的关键参数包括信噪比、信号本底比和Z因子（量化HTS的试验质量）。Z因子高于0.5表示试验质量极佳。变异系数应较低，通常低于10%。

试验微型化减少试剂消耗并提高通量。现代HTS试验在384孔或1536孔板中进行，总体积为5–50 µL。均相试验（无需洗涤步骤）因速度和简便性而受到青睐。

基于荧光的读数在HTS中最常见。荧光强度、荧光偏振、荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨FRET（TR-FRET）被广泛使用。发光试验（包括萤火虫荧光素酶报告基因试验和生物发光共振能量转移BRET）提供高灵敏度和低本底。

AlphaScreen技术使用基于微珠的化学发光，特别适用于检测生物分子相互作用。基于吸光度的试验简单稳健但灵敏度较低。无标记方法如表面等离子体共振（SPR）和质谱法可直接检测结合，无需荧光标记。

HTS库通常包含数十万至数百万个化合物。多样性库旨在覆盖广泛的化学空间，而聚焦库靶向特定蛋白质家族如激酶或GPCR。片段库包含用于基于片段筛选的低分子量化合物。

库质量通过化合物纯度、稳定性和物理化学性质评估。利平斯基五规则指导类药物性质：分子量低于500 Da，logP低于5，氢键供体不超过5个，氢键受体不超过10个。泛试验干扰化合物（PAINS）被标记为通过非特异性机制产生假阳性的频繁命中化合物。

HTS依赖集成机器人系统处理板储存、液体分配、孵育、洗涤和检测。洗板机、多通道移液器和声波液滴喷射器实现纳升级别的精确液体处理。环境控制维持基于细胞试验的温度、湿度和CO2水平。

筛选通量以每天板数或每周化合物数衡量。100,000个化合物在384孔格式中的典型HTS活动需要约260块板。超高通量平台每天可筛选超过100万个化合物。

初筛数据经过标准化和板间变异校正。抑制百分比或活性相对于阳性和阴性对照计算。Z分数测量偏离板均值的标准差数。命中选择阈值通常设为高于均值3个标准差或特定抑制百分比界限。

命中确认包括在原始试验中重新测试和测试浓度依赖性活性。反筛选排除干扰检测技术而非靶标的化合物。选择性试验评估对相关靶标的活性。混杂化合物通过其平坦的构效关系和跨多个无关试验的活性来识别。

确认的命中经过药物化学优化以提高效力、选择性和类药物性质。构效关系（SAR）研究确定负责活性的关键官能团。ADME（吸收、分布、代谢、排泄）分析评估药代动力学特性。动物模型中的体内药效研究验证优化先导物的治疗潜力。