固定化金属亲和层析通过多聚组氨酸标签的组氨酸侧链咪唑环与固定化过渡金属离子（Ni²⁺或Co²⁺）结合，并用咪唑或低pH洗脱，纯化多聚组氨酸标签的重组蛋白。

原理

多聚组氨酸标签——通常为6至10个连续组氨酸残基——融合到重组蛋白的N端或C端。组氨酸的咪唑侧链与固定化在层析支持物上的螯合二价金属离子（Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺）配位，通过次氮基三乙酸或亚氨基二乙酸螯合剂固定。Ni-NTA（次氮基三乙酸）为Ni²⁺离子提供四个配位位点，留下两个位点用于组氨酸结合。该相互作用是可逆的：咪唑（20–500 mM）竞争性置换组氨酸标签，或低pH（4.5–5.5）质子化组氨酸侧链，破坏金属配位。

树脂类型

Ni-NTA琼脂糖（Qiagen、Thermo Fisher）是最广泛使用的IMAC树脂。结合容量通常为每mL沉降树脂5–10 mg 6×His标签蛋白。Ni-Sepharose（GE Healthcare）为FPLC应用提供更高流速。TALON（Clontech/TaKaRa）使用Co²⁺-羧甲基天冬氨酸树脂，提供比Ni-NTA更高的特异性且非特异性结合更低，但容量较低。磁珠（Dynabeads His-Tag、MagnaHis）实现从小体积的分批纯化。高容量树脂（高达40 mg/mL）可用于制备型纯化。

缓冲液

裂解/上样缓冲液：20–50 mM Tris或磷酸盐pH 7.5–8.0，300–500 mM NaCl（抑制离子相互作用），10–20 mM咪唑（减少非特异性结合）。洗涤缓冲液：相同成分，含20–40 mM咪唑。洗脱缓冲液：200–500 mM咪唑或pH梯度至4.5。NaCl浓度至关重要——较低的盐增加酸性蛋白的非特异性结合。添加剂如1 mM DTT或TCEP防止表面半胱氨酸氧化。对于膜蛋白，可加入与IMAC兼容的0.1–1%去垢剂（DDM、CHAPS、洋地黄皂苷）。

方案

在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解细胞。离心澄清（20,000 g，30分钟）和过滤（0.45 µm）。用5倍体积裂解缓冲液平衡树脂。将澄清裂解液与树脂孵育（分批模式：4 °C旋转30分钟，或柱模式：以0.5–1 mL/min上样）。用10–20倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，直到UV基线稳定。用5–10倍体积洗脱缓冲液洗脱，收集级分。通过SDS-PAGE和Western blot或Bradford法分析级分。

标签位置与切割

6×His标签可放置在任一端。N端标签更常见且在大肠杆菌中产生更高表达，但C端标签降低影响N端信号序列的风险。通过在标签和蛋白之间引入TEV、凝血酶或Factor Xa蛋白酶切割位点可去除标签。在洗脱后进行切割，随后进行减法IMAC步骤以去除切割后的标签和未切割的蛋白。

应用

His标签/IMAC是分子生物学中最广泛使用的蛋白质纯化方法。它适用于在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的可溶性蛋白质。它还纯化在去垢剂中溶解的膜蛋白、在变性条件下（8 M尿素或6 M盐酸胍）纯化的包涵体蛋白，以及通过相互作用伙伴的顺序标记（共IMAC）纯化的蛋白质复合物。小标签大小很少干扰蛋白质功能，使其成为亲和捕获、结构研究和酶学测定的理想选择。