下一代测序 (NGS) 包含一套现代测序技术，可以并行测序数百万个 DNA 片段，从而可以快速且经济地对整个基因组进行测序。 Illumina、Ion Torrent 和 PacBio 等平台在该领域占据主导地位。
NGS 的工作原理（Illumina 平台）
- 文库准备
DNA 被分成小片段，通常为 200-600 个碱基对。接头（短的已知序列）连接到每个片段的两端。这些接头允许片段与流动池结合并作为测序的引发位点。
- 簇生成
将文库加载到表面涂有互补寡核苷酸的流动池上。每个片段与流动池结合并经历桥式扩增：片段弯曲，合成一条新链，然后重复该过程，创建每个片段的数千个相同副本的簇。
- 合成测序
荧光标记的核苷酸一次一个地流过流动池。每个核苷酸都有一个可逆终止子，每个循环只允许添加一个碱基。每个循环后，对荧光进行成像，以识别每个簇中添加了哪些碱基。
- 数据分析
生成数百万个测序读数。这些读数与参考基因组比对或从头组装。生物信息学工具根据应用识别遗传变异、基因表达水平或表观遗传修饰。
- 应用
NGS 用于全基因组测序、靶向基因组、RNA 测序、表观遗传分析和宏基因组学以及许多其他应用。
实用 NGS 文库制备工作流程
从 10–100 ng 高质量基因组 DNA 开始（A260/A280 > 1.8，A260/A230 > 2.0）。使用 Covaris 超声波仪或酶促片段化对 DNA 进行片段化，以达到 200-600 bp 的目标大小。执行末端修复以生成平末端，然后使用 Klenow 片段进行 A 加尾（在 3’ 末端添加单个腺苷）。使用 T4 DNA 连接酶将包含 5’T 突出端的 Illumina 兼容适配器连接到 A 尾片段。使用 AMPure XP 珠子以 0.8× 珠子与样品的比例纯化连接产物，以去除未连接的接头。使用与接头序列互补的引物，通过 PCR 扩增接头连接的文库 8-12 个循环；包括用于样品复用的独特双索引条形码。用 AMPure XP 珠以 0.8× 的比例清理 PCR 产物。使用 Bioanalyzer 或 TapeStation（预期大小分布：250–700 bp）和 Qubit 荧光定量评估文库质量和数量。将文库标准化至 4 nM，等摩尔合并，并用 0.2 N NaOH 变性，然后以 1.8 pM 加载到 Illumina 流动池上进行 2 × 150 bp 双端测序。监控簇密度（目标：HiSeq 4000 为 800–1,200 K/mm²）和 Q30 分数（对于高质量运行，>80%）。使用 bcl2fastq 对输出进行多路分离，并使用 FastQC 评估每个碱基的质量。对齐前使用 Trimmomatic 修剪适配器和低质量底座。
实际应用
在临床癌症基因组学中，覆盖 500 个癌症相关基因的靶向 NGS 组合用于分析患者的肿瘤活检。使用 50 ng FFPE DNA 制备文库可产生 94% 的目标，覆盖深度 >100 倍。该分析确定了 KRAS G12C 突变 (0.46 VAF) 和 EGFR 扩增，指导 MEK 抑制剂的治疗选择。
