概述

磷酸化蛋白质组学是对蛋白质磷酸化的大规模研究，蛋白质磷酸化是最普遍且功能上最重要的翻译后修饰之一。磷酸化几乎调节细胞生命的各个方面，包括酶活性、蛋白质-蛋白质相互作用、亚细胞定位和信号转导。磷酸化蛋白质组学旨在识别哪些蛋白质被磷酸化、哪些残基（主要是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）被磷酸化，以及磷酸化状态如何响应刺激而变化。该领域将磷酸肽富集策略与高分辨率质谱和专门的生物信息学相结合，以前所未有的深度绘制磷酸蛋白质组图谱。

关键概念

磷酸肽富集至关重要，因为磷酸化肽相对于非磷酸化肽通常是亚化学计量的。常见的富集方法包括固定金属亲和色谱 (IMAC) 和二氧化钛 (TiO2) 色谱，这两种方法都利用磷酸基团对金属氧化物的亲和力。 位点定位算法（例如 Ascore、Mascot Delta Score 和 MaxQuant 的定位概率）确定携带磷酸盐的确切残基。 基序分析识别磷酸化位点周围的序列模式，以推断上游激酶偏好。激酶-底物关系可以从这些基序预测并通过实验验证。

实用协议

标准磷酸蛋白质组学工作流程从蛋白质提取和消化开始。细胞或组织在含有磷酸酶抑制剂（例如原钒酸钠、β-甘油磷酸盐）的变性缓冲液中裂解，以保持磷酸化状态。用胰蛋白酶消化蛋白质过夜，并使用 C18 柱对所得肽混合物进行脱盐。关键的富集步骤如下：将肽混合物加载到 TiO2 或 IMAC 柱上，其中磷酸肽通过其磷酸基团与金属氧化物或固定的金属离子结合。非磷酸化肽用含有 80% 乙腈和 0.5% 三氟乙酸的缓冲液洗去，而磷酸肽则用碱性磷酸盐缓冲液或 5% 氨溶液洗脱。在高分辨率 Orbitrap 质谱仪上使用 [毛细管区带电泳](/guides/capillary-zone- electrophoresis) 通过 LC-MS/MS 或 CE-MS 对富集组分进行分析。使用 MaxQuant 处理原始数据，并将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化设置为可变修饰。 MaxQuant 的位点定位概率分数确定了准确的磷酸化残基。下游分析包括使用 IceLogo 等工具进行基序富集，以识别激酶共有序列，以及使用激酶底物富集分析 (KSEA) 进行激酶底物网络推断。在实际应用中，该工作流程绘制了 EGF 刺激的 HeLa 细胞中 20,000 多个磷酸位点，揭示了刺激后几分钟内 EGFR 信号网络的动态磷酸化。另一个例子是 DNA 损伤反应磷酸化蛋白质组的系统图谱，其中 5,000 个受调节的磷酸位点识别出对细胞周期检查点激活和 DNA 修复至关重要的 ATM 和 ATR 激酶底物。

应用程序

磷酸蛋白质组学对于理解细胞信号传导 网络至关重要。它绘制了受体酪氨酸激酶和[G蛋白偶联受体](/guides/g- Protein- Coupled-receptors.html)下游的信号级联，揭示了与第二信使通路的串扰，并阐明了JAK-STAT信号 轴。在癌症研究中，磷酸蛋白质组学识别出可作为治疗靶点的异常活性激酶，从而实现精确的肿瘤学方法，将抑制剂与驱动肿瘤生长的失调信号节点相匹配。