病毒滴度测定对于研究、疫苗生产和临床诊断中的感染性病毒定量至关重要。空斑测定是测量感染性病毒滴度的标准方法。

空斑测定原理

当病毒感染培养皿中易感细胞的单层时，它会复制并传播到邻近细胞。经过几轮感染后，出现局部细胞死亡区域。每个空斑被认为起源于单个感染性病毒颗粒。

过程：

1. 在多孔板中培养易感细胞的汇合单层。
2. 用系列稀释的病毒样品感染单层。
3. 让病毒吸附 1–2 小时，期间定期摇动。
4. 用半固体培养基覆盖细胞，防止病毒通过液体培养基扩散。
5. 孵育 2–10 天直至空斑可见。
6. 固定并染色单层。空斑在染色细胞背景上呈现透明区域。

计数空斑并计算：空斑形成单位每毫升 = 空斑数 /（稀释度 × 铺板体积 mL）。

TCID₅₀ 测定

TCID₅₀ 测定是一种终点稀释方法，无需空斑可视化。将系列稀释的病毒加到含有易感细胞的 96 孔板的重复孔中。孵育后，对孔评分是否存在细胞病变效应。TCID₅₀ 是 50% 孔出现 CPE 的稀释度，通过 Reed–Muench 或 Spearman–Kärber 方法计算。

TCID₅₀/mL 值可转换为 PFU/mL（大约 1 PFU ≈ 0.7 TCID₅₀ 单位），但关系不精确，取决于病毒和细胞类型。

荧光灶测定

对于不产生清晰空斑或 CPE 的病毒，通过免疫荧光检测病毒蛋白。固定受感染的单层，并用针对病毒抗原的荧光抗体染色。在荧光显微镜下计数荧光灶，得到每毫升的灶形成单位。

血凝试验

某些病毒具有血凝素蛋白，可结合并凝集红细胞。在 V 形底板中将系列稀释的病毒与红细胞混合。血凝滴度是仍引起凝集的最高稀释度。HA 检测快速且廉价，但测量的是总病毒颗粒而非感染性颗粒。