联合国粮农组织/世界卫生组织将益生菌定义为“活的微生物，摄入足够量时可为宿主带来健康益处”。最广泛记录的属是乳杆菌属（鼠李糖乳杆菌 GG、干酪乳杆菌代田乳杆菌、嗜酸乳杆菌）和双歧杆菌属（乳双歧杆菌 BB-12、长双歧杆菌婴儿亚种）以及酵母布拉氏酵母菌。该定义要求通过属、种和菌株水平特征来鉴定菌株，并在人体研究中证明对特定声明的健康益处。

益生菌的作用机制是多因素的。竞争性排斥涉及占据肠上皮细胞上的粘附位点并与病原体竞争营养。通过未消化的碳水化合物发酵产生短链脂肪酸（SCFA；乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐），可降低管腔 pH 值，抑制病原体，并作为结肠细胞的能量来源。免疫调节包括增强分泌型 IgA、调节树突状细胞和 T 调节细胞反应以及减少促炎细胞因子。益生菌还通过上调紧密连接蛋白来增强肠道屏障。

临床证据支持的健康益处包括预防和减少抗生素相关性腹泻 (AAD)，特别是鼠李糖乳杆菌 GG 和布拉氏链球菌。还确立了预防艰难梭菌感染、减少早产儿坏死性小肠结肠炎、治疗肠易激综合征 (IBS) 症状以及缓解儿童急性传染性胃肠炎的功效。新出现的证据支持其在代谢健康、情绪调节（肠脑轴）和过敏预防方面的作用，但还需要更多的研究。

保质期结束时，每份所需的活菌剂量通常为 10⁶ 至 10⁹ CFU。生产和储存过程中的活力受到氧敏感性（特别是双歧杆菌）、水分活度、储存温度和发酵产品酸度的影响。保护技术包括微囊化、冷冻保护剂冷冻干燥以及酸和胆汁耐受性菌株选择。监管框架（美国的 GRAS、欧盟的 QPS）要求对新菌株进行安全评估。益生菌菌株必须能够在发酵剂生产和储存中存活。 益生元和合生元可以增强它们的健康益处。许多益生菌都是乳酸菌。