蛋白质是大而复杂的分子，在生物体中执行多种功能。它们的功能与其结构密切相关，结构分为四个不同的层次：一级、二级、三级和四级。

蛋白质结构的四个层次

主要结构

一级结构是多肽链中氨基酸的线性序列。每种蛋白质都有由相应基因决定的独特序列。即使是单个氨基酸的变化也可以改变蛋白质的功能，如镰状细胞贫血症中单个缬氨酸取代谷氨酸的情况。

二级结构

二级结构是指由于主链原子之间的氢键作用而在多肽链内形成的局部折叠结构。最常见的两种类型是α螺旋，一种右旋螺旋，由每四个氨基酸之间的氢键稳定，以及β折叠，一种由平行或反平行的相邻多肽片段之间的氢键形成的扁平褶皱结构。

三级结构

三级结构是单个多肽链的整体三维形状。它通过侧链之间几种类型的相互作用来稳定：疏水相互作用（非极性侧链聚集在蛋白质内部）、极性侧链之间的氢键、带相反电荷的侧链之间的离子键和二硫键（半胱氨酸残基之间的共价键）。

四级结构

四级结构描述了多个多肽链如何组装成功能性蛋白质复合物。例如，血红蛋白由四个多肽亚基（两条 α 链和两条 β 链）组成，它们共同运输氧气。

蛋白质折叠

蛋白质自发地或在分子伴侣的帮助下折叠成其天然的三维结构。错误折叠的蛋白质可以形成聚集体，并与阿尔茨海默氏症和帕金森氏症等疾病有关。

实用蛋白质结构测定和可视化

三种主要实验方法以原子分辨率确定蛋白质结构。 X 射线晶体学 需要浓缩至 5–20 mg/mL 的高纯度蛋白质 (>95%)。使用稀疏矩阵试剂盒（例如，Hampton Research）通过 96 孔坐滴蒸气扩散试验筛选结晶条件。通过改变 pH、沉淀剂浓度和温度来优化命中。将衍射质量晶体 (0.1–0.5 mm) 安装在冷冻环中，在液氮中以 100 K 快速冷却，并在同步加速器光束线处收集衍射数据。使用 XDS 或 iMosflm 处理数据，使用同源结构通过分子替换 (Phaser) 解决相位问题，在 Coot 中构建模型，并使用 phenix.refine 对其进行细化。目标分辨率：<3.0 Å；良好的结构具有 Rwork/Rfree < 0.20/0.25。 **核磁共振 (NMR) 光谱**适用于 10% D2O 中浓度为 0.5–1 mM 的小蛋白质 (<30 kDa)。记录 2D 15N-HSQC、3D 三重共振谱（HNCA、HNCO、CBCA(CO)NH）和 NOESY 以进行距离限制。手动或使用自动化软件（例如 CARA、NMRFAM-SPARKY）分配主链共振。使用 CYANA 或 Xplor-NIH 根据 NOE 导出的距离约束和二面角计算结构。 冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 是大型复合物 (>150 kDa) 的首选方法。将 3 µL 样品 (0.1–1 mg/mL) 涂抹到辉光放电多孔碳网格上，吸干 3–4 秒，然后在液体乙烷中骤冷。使用 K2 或 K3 探测器在 300 kV 的 Titan Krios 上收集电影。通过运动校正、CTF 估计、粒子拾取（2D 分类）、从头重建、3D 分类和高分辨率细化，使用 RELION 或 CryoSPARC 进行处理。对于结构可视化，使用 PyMOL 或 ChimeraX 加载 PDB 文件。将蛋白质显示为卡通（二级结构着色）、表面（静电势）或棒（活性位点残基）。测量原子之间的距离、角度和氢键。

实际应用

在大流行爆发后的几个月内，通过冷冻电镜将 SARS-CoV-2 刺突蛋白（150 kDa 胞外域）解析至 3.3 Å 分辨率。该结构揭示了与 ACE2 结合的“向上”构象的受体结合域 (RBD)，从而实现基于结构的疫苗设计。 RBD-ACE2 界面的 PyMOL 可视化确定了关键接触残基（K417、N501、Y453），指导中和抗体的开发。