RNA 干扰是一种自然机制，小 RNA 分子通过靶向互补 mRNA 进行降解或翻译抑制来沉默基因表达。它是功能基因组学中最强大的工具之一。

机制

RNAi 通路始于双链 RNA，被 Dicer 酶切割为 21–23 核苷酸的小干扰 RNA。这些 siRNA 被加载到 RNA 诱导沉默复合体（RISC）中，其中 guide 链被保留，passenger 链被丢弃。Guide 链与互补 mRNA 配对，Argonaute-2（Ago2）——RISC 的催化组分——切割 mRNA，阻止翻译。

内源性 microRNA 遵循类似的通路，但源于发夹前体。大多数 miRNA 与靶 mRNA 的 3′ UTR 不完全互补结合，导致翻译抑制而非切割。

实验性 RNAi 工具

• 合成 siRNA：21 bp dsRNA 双链体，带有 2 nt 突出端。直接转染到细胞中。有效 3–7 天。是最常见的瞬时敲低方法。
• shRNA（短发夹 RNA）：从质粒或病毒载体表达。发夹被 Dicer 加工为 siRNA。shRNA 可使用慢病毒载体稳定整合，实现长期敲低和稳定细胞系的建立。
• miRNA 模拟物和抑制剂：模拟内源性 miRNA 或阻断它们的合成 RNA。用于研究特定 miRNA 功能。

设计考虑因素

有效的 siRNA 设计要求：

• 靶向基因的编码区或 3′ UTR
• 避免脱靶匹配
• GC 含量在 35–55% 之间
• 避免内部重复和二级结构

建议每个靶标使用多个 siRNA。包括非靶向（scrambled）siRNA 对照以区分特异性和非特异性效应。阳性对照确认转染和 RNAi 机制正在工作。

局限性

• 脱靶效应：siRNA 可通过部分互补性沉默非目标基因，特别是在种子区域。
• 干扰素反应：长 dsRNA 会触发先天免疫反应。使用纯化的合成 siRNA 可避免此问题。
• 持久性：siRNA 随细胞分裂被稀释。对于长期实验，使用 shRNA 或多次转染。
• 不完全敲低：残留蛋白可能仍具有功能。在 mRNA 和蛋白水平确认敲低。