概述

变异调用是识别个体基因组和参考基因组之间差异的计算过程。这些差异范围从单核苷酸多态性 (SNP) 和小插入或缺失 (indel) 到大的结构变异，例如拷贝数变化和染色体重排。准确的变异检测是人类遗传学、精准医学和进化生物学的基石。该过程需要仔细的统计建模，以区分真正的生物变异与测序错误和比对伪影。

关键概念

大多数变异调用者遵循共同的工作流程：首先使用 BWA 或 Bowtie2 等工具将测序读数与参考基因组进行比对，然后处理比对数据以识别个体序列与参考序列不同的位置。 基因组分析工具包 (GATK) 最佳实践流程被广泛采用，使用贝叶斯方法来计算基因型可能性。主要考虑因素包括覆盖深度（深度越高，置信度越高）、碱基质量分数和作图质量。使用硬阈值或机器学习（例如 VQSR）进行变异过滤可以消除误报。结构变异检测需要专门的工具（例如 DELLY 或 Manta）来分析不一致的读段对和分割读段。

应用程序

变异识别推动了临床和研究基因组学的发展。它可以识别罕见遗传疾病的突变，并通过在肿瘤与正常比较中揭示体细胞突变来为癌症基因组学提供信息。千人基因组计划等人口规模项目已经对数百万种变异进行了编目，以绘制人类多样性图谱。在传染病中，变异调用追踪病原体进化和耐药性。变异调用的准确性从根本上取决于[下一代测序](/guides/next- Generation-sequencing.html)数据的质量和所使用的DNA测序平台。

实用协议

种系短变异发现的 GATK 最佳实践工作流程分为几个阶段。从 BWA-MEM 中对齐的 BAM 文件开始：bwa mem -t 8 -R "@RG\tID:sample\tSM:sample\tLB:lib\tPL:ILLUMINA" reference.fasample_R1.fastqsample_R2.fastq >aligned.sam。使用“samtools sort”进行排序并转换为 BAM。使用“GATK MarkDuplicates”标记重复项来标记 PCR 重复项，然后使用“samtools index”进行索引。碱基质量分数重新校准 (BQSR) 可纠正碱基质量中的系统错误：首先使用“Gatk BaseRecalibrator -R reference.fa -I dedup.bam –known-sites dbsnp.vcf -O recal.table”构建重新校准模型，然后使用“Gatk ApplyBQSR -R reference.fa -I dedup.bam –bqsr-recal-file recal.table -O recal.bam”应用。对单个样本的变体调用使用“Gatk HaplotypeCaller -R reference.fa -I recal.bam -O sample.g.vcf -ERC GVCF”，生成用于联合基因分型的 gVCF。使用“Gatk GenomicsDBImport”聚合样本，并与“Gatk GenotypeGVCFs -R reference.fa -V同类.g.vcf -O raw_variants.vcf”联合调用。变体过滤使用变体质量得分重新校准 (VQSR)：“Gatk VariantRecalibrator”使用已知的真实位点（HapMap、Omni、1000G）构建高斯混合模型，“Gatk ApplyVQSR”应用分级过滤器（通常对 SNP 的灵敏度为 99.0%，对 indels 的灵敏度为 99.5%）。对于结构变异检测，运行“Manta”及其配置脚本，然后执行工作流程。使用“Gatk CollectVariantCallingMetrics”评估最终调用集并检查转换/转换比率 - Ti/Tv 约为 2.0-2.1 表明人类全基因组数据的质量很高。