酶谱是一种电泳技术，用于检测蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶和其他水解酶的酶活性。最常见的应用是检测生物样品中的基质金属蛋白酶活性。
原理
蛋白质样品在非还原条件下进行 SDS-PAGE。分离胶与底物共聚，通常为明胶（0.1% w/v）用于检测 MMP-2 和 MMP-9，或酪蛋白用于更广泛的蛋白酶检测。电泳后，通过在 Triton X-100 溶液中洗涤去除 SDS，使蛋白酶复性。然后将凝胶在显色缓冲液中于 37 °C 孵育 12–48 小时，在此期间活性蛋白酶在其附近消化底物。用考马斯亮蓝染色后，在底物被消化的深蓝色背景上出现透明条带。
操作
- 制备含 0.1% 明胶或酪蛋白的分离胶。包含不含底物的浓缩胶。
- 不煮沸且不含还原剂的情况下上样。使用非还原样品缓冲液。
- 在 4 °C 下以 100–150 V 电泳，防止电泳过程中蛋白水解。
- 在复性缓冲液中于室温轻轻摇动洗涤凝胶 2 × 30 分钟。
- 在显色缓冲液中短暂洗涤。
- 在显色缓冲液中于 37 °C 孵育 12–48 小时。
- 用考马斯亮蓝 R-250 染色 1 小时。
- 脱色至透明条带可见。
- 对凝胶成像并通过光密度法定量条带。
结果解读
条带表现为蓝色背景上的透明区域。其位置指示分子量，强度与活性酶量成正比。透明条带的分子量应对应于预期蛋白酶的前体形式或活性形式。例如，pro-MMP-9 出现在约 92 kDa，活性 MMP-9 在约 82 kDa，pro-MMP-2 在约 72 kDa，活性 MMP-2 在约 62 kDa。
反向酶谱
为了检测蛋白酶抑制剂，凝胶与底物和标准蛋白酶共聚。显色和染色后，抑制剂条带表现为底物未被消化的深色区域，而在其他位置添加的蛋白酶已消化底物形成透明背景。
应用
酶谱用于测量肿瘤提取物、伤口液、滑液和细胞培养上清中的 MMP 活性。它是癌症生物学、心血管疾病和组织重塑中的标准检测方法。定量酶谱可在同一凝胶上加载纯化的 MMP 标准品。
局限性
酶谱检测的是该分子量处的总蛋白水解活性，不一定是单一酶，多种蛋白酶可能共迁移。它在绝对意义上也不是真正定量的。对于特异性活性测量，首选基于 ELISA 的活性检测或 FRET 底物切割检测。
