Elektroforesis kapiler (CE) adalah sekelompok metode pemisahan elektrokinetik yang dilakukan dalam kapiler silika leburan sempit dengan diameter dalam 25 hingga 100 mikrometer. Medan listrik sebesar 100 hingga 500 V/cm diterapkan di sepanjang kapiler, mendorong analit bermuatan menuju elektroda lawan dengan kecepatan yang ditentukan oleh mobilitas elektroforetiknya. CE menggabungkan efisiensi pemisahan tinggi (sering melebihi 100.000 plat teoretis) dengan waktu analisis singkat, konsumsi sampel minimal (nanoliter), dan kompatibilitas dengan buffer berair dan non-berair. CE telah menjadi platform penting dalam analisis farmasi, diagnostik klinis, ilmu forensik, proteomik, dan metabolomik, menawarkan mekanisme pemisahan yang ortogonal terhadap kromatografi cair dan elektroforesis gel.
Prinsip Mobilitas Elektroforetik
Ketika medan listrik diterapkan pada suatu larutan, partikel bermuatan mengalami gaya elektrostatik yang sebanding dengan muatan bersihnya (q) dan kuat medan (E). Partikel tersebut berakselerasi hingga gaya hambat dari medium sekitarnya menyamai gaya elektrostatik, setelah itu ia bermigrasi dengan kecepatan konstan. Mobilitas elektroforetik (µ_ep) didefinisikan sebagai kecepatan per unit kuat medan dan sebanding dengan q dibagi dengan radius hidrodinamik (r) partikel. Ion kecil dengan muatan tinggi memiliki mobilitas tinggi, sementara spesies besar atau bermuatan lemah bermigrasi lebih lambat. Migrasi diferensial ini adalah dasar dari semua pemisahan elektroforetik.
Aliran Elektroosmotik
Aliran elektroosmotik (EOF) adalah fenomena khas dalam CE yang timbul dari lapisan ganda listrik pada dinding kapiler silika leburan. Pada pH di atas sekitar 3, gugus silanol pada permukaan dalam kapiler mengalami deprotonasi, menciptakan dinding bermuatan negatif. Kation dari buffer terakumulasi di dekat dinding membentuk lapisan ganda listrik yang difus. Ketika medan listrik diterapkan, kation terhidrasi ini bermigrasi menuju katoda, menarik larutan bulk bersamanya. Profil EOF yang dihasilkan hampir datar (seperti sumbat), berbeda dengan profil aliran parabola dari sistem yang digerakkan oleh tekanan seperti HPLC. Aliran sumbat ini meminimalkan pelebaran zona, berkontribusi pada efisiensi pemisahan yang sangat tinggi yang diamati dalam CE. Besaran dan arah EOF tergantung pada pH buffer, kekuatan ionik, dan kimia dinding kapiler, dan dapat ditekan atau dibalik melalui pelapis dinding atau modifier dinamis.
Instrumentasi
Instrumen CE terdiri dari catu daya tegangan tinggi (biasanya 0 hingga 30 kV), dua reservoir buffer dengan elektroda platinum, kapiler silika leburan (panjang 25 hingga 100 cm), dan detektor. Kapiler melewati detektor, memungkinkan deteksi pada kolom tanpa memerlukan pipa derivatisasi pasca-kolom. Introduksi sampel dilakukan dengan mengganti satu reservoir buffer dengan vial sampel dan memberikan tekanan (injeksi hidrodinamik) atau tegangan (injeksi elektrokinetik) untuk waktu tertentu. Injeksi hidrodinamik lebih disukai untuk pekerjaan kuantitatif karena volume yang dimasukkan tidak tergantung pada matriks sampel, sementara injeksi elektrokinetik menghasilkan bias terhadap analit yang lebih mobile tetapi dapat mencapai sensitivitas yang lebih tinggi untuk komponen jejak.
Mode Deteksi
Deteksi serapan UV-Vis adalah metode deteksi CE yang paling umum, biasanya dilakukan melalui jendela yang dibuat dengan menghilangkan lapisan polimida dari kapiler. Serapan diukur melintasi diameter kapiler, yang membatasi panjang jalur optik ke diameter dalam kapiler (25 hingga 100 µm), menghasilkan sensitivitas yang moderat (mikromolar rendah). Deteksi fluoresensi terinduksi laser (LIF) memberikan sensitivitas yang jauh lebih tinggi (tingkat attomol hingga zeptomol) untuk analit yang diberi label fluoresen, menjadikannya metode pilihan untuk sekuensing DNA dan analisis jejak. Deteksi elektrokimia (amperometri dan konduktivitas) digunakan untuk spesies elektroaktif dan ion anorganik kecil. CE yang digabungkan dengan spektrometri massa (CE-MS) melalui ionisasi elektrospray memberikan efisiensi pemisahan tinggi dan identifikasi struktural, dan banyak digunakan dalam proteomik dan metabolomik untuk analisis peptida, protein, dan metabolit polar.
Mode Pemisahan
CE mencakup beberapa mode operasional yang mengeksploitasi mekanisme pemisahan yang berbeda. Elektroforesis zona kapiler (CZE) memisahkan analit berdasarkan rasio muatan-ukuran dalam larutan bebas dan merupakan mode yang paling banyak digunakan. Elektroforesis gel kapiler (CGE) menggunakan gel polimer atau matriks polimer linier untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran, dan merupakan platform standar untuk sekuensing DNA dan profiling DNA forensik. Fokusing isoelektrik kapiler (CIEF) memisahkan molekul amfoter seperti protein berdasarkan titik isoelektriknya (pI) dalam gradien pH. Isotakoforesis kapiler (CITP) menggunakan sistem buffer diskontinu untuk memfokuskan analit ke dalam zona yang tajam dan terkonsentrasi, dan sering digunakan untuk prakonsentrasi sampel sebelum CZE. Kromatografi elektrokinetik miselar (MEKC) memperkenalkan misel surfaktan sebagai fase pseudo-stasioner, memungkinkan pemisahan analit netral melalui partisi hidrofobik. Pilihan mode tergantung pada sifat analit dan tujuan pemisahan.
Perbandingan dengan HPLC
CE dan HPLC adalah teknik pemisahan yang komplementer. HPLC memisahkan analit berdasarkan partisi antara fase diam dan fase gerak, sedangkan CE memisahkan berdasarkan perbedaan mobilitas elektroforetik dalam larutan bebas. CE biasanya menawarkan jumlah plat yang lebih tinggi (100.000 hingga 500.000 plat per meter) dibandingkan HPLC, namun sensitivitas konsentrasi yang lebih rendah karena panjang jalur optik yang pendek dan volume injeksi yang kecil. CE sangat menguntungkan untuk spesies bermuatan, polar, dan ionik yang mungkin sulit dipertahankan pada kolom HPLC fase terbalik. Pengembangan metode dalam CE disederhanakan oleh berbagai macam mode pemisahan dan kemampuan untuk memanipulasi selektivitas melalui komposisi buffer, pH, dan aditif tanpa perlu mengganti kolom.
