Ko-Imunopresipitasi (Co-IP) adalah metode yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi interaksi protein–protein dalam kondisi alami. Ini menggunakan antibodi spesifik untuk menangkap protein umpan dan protein apa pun yang terikat padanya dari lisat sel.

Prinsip

Antibodi terhadap protein target (umpan) diimobilisasi pada pendukung padat — biasanya manik-manik agarosa Protein A/G atau manik-manik magnetik. Ketika manik-manik yang terkonjugasi antibodi diinkubasi dengan lisat sel atau jaringan, protein umpan ditangkap bersama dengan protein apa pun yang terkait secara fisik dengannya. Setelah mencuci bahan yang tidak terikat, protein yang terikat dielusi dan dianalisis dengan Western blot atau spektrometri massa.

Ikhtisar Protokol

1. Siapkan lisat menggunakan buffer lisis ringan non-denaturasi yang mempertahankan interaksi protein (misalnya, 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, inhibitor protease). Pertahankan sampel di atas es.
2. Pra-bersihkan lisat dengan menginkubasi dengan manik-manik kosong (tanpa antibodi) untuk menghilangkan protein yang berikatan secara non-spesifik ke permukaan manik.
3. Inkubasi lisat yang telah dibersihkan dengan manik-manik terkonjugasi antibodi pada 4 °C selama 1–4 jam (atau semalaman) dengan rotasi lembut.
4. Cuci manik-manik 3–5 kali dengan buffer lisis dingin. Kekakuan dapat ditingkatkan dengan menaikkan konsentrasi garam (250–500 mM NaCl) atau menambahkan deterjen ringan (0,1% Tween-20).
5. Elusi protein terikat dengan buffer sampel SDS-PAGE dan panas (5 menit pada 95 °C).
6. Analisis dengan Western blot (untuk interaktor yang diketahui) atau spektrometri massa (untuk penemuan).

Kontrol

Kontrol yang ketat sangat penting:

• Kontrol isotipe: gunakan antibodi non-spesifik dengan isotipe yang sama untuk membedakan pengikatan spesifik dari latar belakang.
• Kontrol hanya manik: manik-manik tanpa antibodi untuk mengidentifikasi protein yang berikatan dengan matriks manik.
• Kontrol knockdown/knockout: lisat dari sel yang kekurangan protein umpan menunjukkan spesifisitas antibodi.
• Co-IP terbalik: lakukan IP timbal balik menggunakan antibodi terhadap interaktor yang dicurigai.

Crosslinking

Antibodi sendiri ikut terelusi dengan target dan dapat mengganggu spektrometri massa. Crosslinking antibodi ke manik-manik (menggunakan DSS atau BS³) sebelum inkubasi mencegah elusi antibodi. Kontrol dengan manik-manik crosslinked harus mengonfirmasi bahwa antibodi masih fungsional setelah crosslinking.

Varian

• Co-IP alami: menggunakan buffer lisis non-denaturasi. Mempertahankan kompleks alami tetapi dapat mengko-presipitasi protein yang terkait secara tidak langsung.
• Co-IP crosslinking: crosslinker reversibel (misalnya, formaldehida, DSP) menstabilkan interaksi lemah atau sementara sebelum lisis.
• Co-IP nuklir: untuk kompleks faktor transkripsi, gunakan protokol ekstraksi nuklir dan sertakan DNase I untuk melepaskan protein yang terikat kromatin.